Septembre 1996 - n°10

Technique analytique CE-LIF-ID (Capillary Electrophoresis Laser Induced Fluorescence Immuno Detection)

Introduction
Les Immuno-essais sont largement utilisés dans le cadre d'analyses quantitatives en environnement biomédical et clinique. Leur principal intérêt réside dans le fait qu'ils permettent de quantifier des traces du composé cible, peptides ou protéines, au sein d'un milieu très complexe et concentré ("matrice") tel que le sérum.
Les immunoessais sont basés sur la réaction spécifique entre un anticorps et l'antigène correspondant. En utilisant des révélations basées sur la radioactivité (RIA), la fluorescence, ou une réaction enzymatique (EIA), une détection de très haute sensibilité peut être atteinte. Le système, le plus couramment utilisé, est celui dans lequel l'anticorps ou l'antigène est immobilisé sur un support tel que la paroi d'un puits de microplaque ou l'intérieur d'un tube à essai.
Bien que donnant d'excellents résultats, les immunoessais phase solide souffrent de quelques inconvénients liés à l'immobilisation sur le support.
En effet, un temps non négligeable est accordé à la mise au point des conditions d'immobilisation afin que celle-ci soit reproductible et stable. En complément, les étapes de lavage ou de rinçage doivent être, elles aussi, développées.
Si la technique EIA est choisie, il convient de développer la procédure de conjugaison et la stabilité de l'enzyme, ainsi que celle des anticorps et antigène.
Si la technique RIA est retenue, il faut tenir compte des coûts liés à l'achat de produits radiomarqués ainsi que ceux liés au traitement des déchets. Le protocole complet est long, I'étape de révélation pouvant durer plusieurs heures, voire toute la nuit.
Considérant ces difficultés, les immunoessais en électrophorèse capillaire peuvent présenter une alternative originale. En effet, les formes liées et libres de l'antigène ou de I'anticorps marqué peuvent être séparées sans utilisation de support solide. En utilisant un composé marqué à la fluorescence et avec une détection par Fluorescence Induite par Laser une limite de détection de l'ordre 10-11 M peut être obtenue.

Description d'un protocole type:
De façon à illustrer cette technique nous pouvons choisir le cas d'une analyse d'immunoessais par compétition. La méthode recourt à l'utilisation d'un antigène purifié (angiotensine 11 utilisé comme exemple) marqué avec le fluorophore cyanine stable (Cy5*).
La réaction immunitaire angiotensine Il / anti-angiotensine 11 se déroule en solution et la séparation, entre la forme libre et liée de l'antigène, est réalisée grâce au pouvoir séparateur de l'électrophorèse de zone (CZE) éliminant ainsi l'étape de rinçage ainsi que celle d'immobilisation.
La détection est faite par Fluorescence Induite par Laser. Dans ces conditions, les peptides et protéines non dérivés ne sont pas détectés. Ainsi les lignes de base sont très propres et les électrophorégrammes faciles à interpréter. Les expériences ont été réalisées sur un système d'électrophorèse capillaire, modèle P/ACE de Beckman équipé d'un détecteur laser He/Ne 633 nm.

conclusion:
Les immunoessais par électrophorèse capillaire avec détection induite par laser offre la possibilité de réaliser des dosages rapides de protéines et peptides au sein de fluides biologiques, y compris le sérum.
Par extension, des dosages simultanés de plusieurs couples anticorps- antigènes sont même envisagés.
Au vu des premiers résultats obtenus et par ses perspectives, ce type de méthode semble être un outil analytique tout à fait prometteur pour la biorecherche, le diagnostic et l'industrie pharmaceutique.
Rétérence

Mr R. GROULT
Mr R. BOCQUENTIN
BECKMAN INSTRUMENTS