Février 1996 - n°5
La luminescence est le phénomène par lequel certaines molécules portées à un état excité retournent à l'état fondamental en restituant une partie de l'énergie sous forme d'émission de lumière. On distingue plusieurs types de luminescence selon la source d'énergie impliquée dans le processus d'excitation.
Lorsque l'énergie qui permet aux molécules d'atteindre l'état excité provient d'une réaction chimique, il s'agit du phénomène de chimiluminescence. La bioluminescence, qui est le phénomène d'émission de lumière observé chez certains organismes vivants, peut être considérée comme un cas particulier de chimiluminescence pour lequel une protéine, le plus souvent enzymatique, est impliquée dans la réaction génératrice de lumière.
La chimiluminescence est à l'origine de signaux utilisables en immunoanalyse, soit pour un dosage, soit pour une recherche qualitative. Deux réactions d'émission de lumière sont particulièrement exploitées dans ce domaine :
- la chimiluminescence des 1,2-dioxétanes,
- la chimiluminescence du luminol.
REACTION DE CHIMILUMINESCENCE DES 1,2-DIOXETANES.
Les 1,2-dioxétanes utilisés pour les mesures par luminescence sont des composés stables à température ambiante et qui, sous l'action de la chaleur, se décomposent en deux produits carbonylés dont l'un est à l'état excité et est donc susceptible d'émettre de la lumière. La stabilité des dioxétanes à température ambiante dépend de la nature des substituants présents sur l'hétérocyclobutane;
Il est possible de synthétiser des dérivés stables non luminescents qui, sous l'action d'un enzyme, produiront un intermédiaire instable se décomposant en émettant de la lumière. C'est le cas de l'AMPPD (3-(2'-spiroadamantane)-4-méthoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phényl-1,2-dioxétane). L'enzyme déclenchant est la phosphatase alcaline. L'hydrolyse enzymatique de cet ester phosphorique génére de l'AMPD-, instable, qui se scinde en deux produits dont l'un, l'anion méthyl m-oxybenzoate émet de la lumière .
Un conjugué marqué par la phosphatase alcaline peut ainsi être détecté par cette méthode. L'addition de micelles constituées de molécules fluorescentes et de bromure de cétyltriméthylammonium permet d'amplifier le signal luminescent produit au cours de cette réaction.
REACTION DE CHIMILUMINESCENCE DU LUMINOL
En milieu alcalin, l'oxydation du luminol (5-amino-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione) produit une émission lumineuse. L'agent oxydant le plus utilisé est le peroxyde d'hydrogène. Cette réaction de chimiluminescence peut être catalysée par la peroxydase de raifort et la quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité de catalyseur si les substrats de la réaction sont en excès.
Ainsi toute molécule marquée par la peroxydase, et en particulier un anticorps, peut-être détectée grâce à cette réaction de chimiluminescence.
D'autres composés que la peroxydase peuvent catalyser cette réaction. On peut notamment citer le ferricyanure, les ions cobalt ou cuivriques et l'hématine. Cependant, la réaction catalysée par la peroxydase a la particularité unique de pouvoir être amplifiée, c'est-à-dire qu'en présence d'amplificateur et pour une même quantité de peroxydase, le signal lumineux sera beaucoup plus intense et prolongé. De cette manière, la sensibilité de cette méthode est grandement améliorée. Les amplificateurs les plus importants qui permettent de multiplier l'intensité lumineuse de plusieurs dizaines à plusieurs centaines de fois sont des dérivés benzothiazole et certains phénols para-substitués.
Le nouveau réactif chimiluminescent développé par CovalAb permet de révéler l'enzyme peroxydase sur des supports solides, membranes, coupes histologiques et cellules en culture.
La peroxydase est utilisée pour catalyser l'oxydation d'une molécule de la famille du luminol en présence de peroxyde. La molécule oxydée passe d'un état excité à un état plus stable en émettant des photons. Ces photons sont détectés soit par radiographie soit à l'aide d'un luminomètre.
L'emploi d'un amplificateur et d'un oxydant originaux (brevetés par CovalAb) permet d'obtenir une émission de lumière plus stable pendant plusieurs heures et plus intense que celle que l'on constate avec les systèmes de référence . Pour une quantité de protéine très faible (de l'ordre du picogramme), ce système de détection permet un gain de sensibilité d'un facteur d'environ dix par rapport aux autres systèmes de détection par chimiluminescence .
Applications :
Les applications possibles du kit chimiluminescent CovalAb sont nombreuses et peuvent trouver pour cadre les procédures analytiques bien connues de type "dot et western blot" pour les protéines et de type "southern et northern blot" pour les aides nucléiques (ADN et ARN).
Ce système de chimiluminescence constitue une alternative avantageuse et prometteuse.
Procédures :
a) Westernblot : (voir protocole),
b) Préparation du réactif chimiluminescent :
La préparation du réactif est très simple : dans le kit, les réactifs chimiluminescents sont conditionnés dans deux flacons séparés. Le substrat (CovA) qui contient le luminol doit être mélangé à l'oxydant (CovB) à raison de : 1 ml de CovA pour une goutte de CovB,
c) Détection et révélation : (voir protocole pour westernblot),
d) Résultats :
Le réactif chimiluminescent CovalAb est le premier produit de conception et de fabrication française.
Ce nouveau réactif utilisé dans les systèmes peroxydases possède les avantages suivants:
* une sensibilité environ 10 fois supérieure à celle des produits existant sur le marché. Ceci permet de travailler avec de faibles quantités de protéines,
* un bruit de fond extrêmement faible,
* une émission lumineuse en plateau pendant une à plusieurs heures. Il est donc facile d'adapter le film employé, le temps d'exposition à la sensibilité souhaité et de réexposer d'autres films.
Protocole pour Western BLOTS
Electrophorèseet Transfert
Technique courantesur membrane : PVDF, Nitrocellulose, Nylon...
Saturation
2 à 4% BSA ou 5% lait écrémé en poudre en
tampon PBS-T
1 heure
Lavage
* PBS-T
1 fois 5 minutes
Anticorps primaire
Dilution dans 1% BSA ou 1% lait écrémé en tampon
PBS-T
1 heure
Lavage
PBS-T
1 fois 10 minutes
3 fois 5 minutes
Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase
Dilution dans 1% BSA ou 1% lait écrémé en tampon PBS-T
1 heure
Utilisation du Kit de chimiluminescence sur les membranes préalablement immunomarquées à la péroxydase
Lavage
PBS-T
2 fois 10 minutes
PBS sans Tween
2 fois 5 minutes
Préparation réactifs chimiluminescents
Mélanger les réactifs 1 ml covA pour 1 goutte de covB (125 µl
de mélange/cm2 de membrane)
Utilisation extemporanée ou à conserver à 4°c
24 h
Détection
Immerger la membrane dans le mélange chimiluminescent,
l'égoutter, et la couvrir d'un film plastique
1 à 10 minutes
Révélation
Mettre en cassette avec un film et révéler le film
30 sec à 10 minutes
par Dr S. EL ALAOUI.