Mars 1996 - n°6
La Polymerase Chain Reaction est une technique d'amplification d'un segment d'ADN compris entre deux régions de séquences connues par un procédé d'extension d'amorce. Elle consiste à utiliser deux amorces oligonucléotidiques de synthèse de 20 à 25 nucléotides complémentaires des extrémités 3' des deux brins d'ADN encadrant la séquence à amplifier. Une de ces amorces est une copie du brin codant et l'autre, une copie du brin non codant. Sous l'action d'une enzyme (l'ADN polymérase), chaque amorce est allongée dans le sens 5'* 3' d'une séquence exactement complémentaire du brin recopié. La répétition des cycles aboutit à une amplification exponentielle de la séquence cible considérée (voir figure ci-dessous).
Cette réaction enzymatique dépend de nombreux facteurs:
FACTEURS INFLUENCANT LA REACTION
LE CHOIX DES AMORCES
Le choix d'amorces efficaces et spécifiques doit respecter plusieurs règles :
- La longueur : le nombre statistique minimum de nucléotides composant une amorce doit être égal à17. En pratique, le nombre de nucléotides se situe entre 20et 30bases.
- La séquence: les séquences des deux amorces du même couple doivent présenter le maximum de divergences et plus particulièrement à l'extrêmité 3', afin d'éviter leur cohybridation. La teneur en G+C doit être d'environ 50 %. La richesse en GC améliore la stabilité du duplex amorce-matrice.
- La concentration: les concentrations optimales pour 30cycles varient entre 10et 50pmoles de chaque amorce.
- Le nombre de cycles : pour obtenir un signal détectable sur gel, il faut une amplification de 10 molécules dans les conditions optimales en 35 cycles. Un nombre de cycles trop élevé provoque l'accumulation de produits non spécifiques.
- La température : la température d'hybridation est spécifique d'une amorce. Elle se calcule à partir de saTd (Température de dissociation), température à laquelle la moitié des duplex formés sont dissociés.
Formule de SUGGS :
Td° = 4(G + C) + 2(A + T)
Cette formule s'applique uniquement aux duplex parfaits de 11à 20bases. Pour des duplex supérieurs à 20 paires de bases, le Td diminue de 5à 10°C par mésappariement. Une température de 2à 5°C au dessous duTd est généralement préconisée pour ne sélectionner que les duplex parfaits.
Formule de Mc Conaughy :
Td = 81,5 - 16,6(Log(Na+)) + 0,41(% G-C) - (600/N)
Pour des hybrides comportant + de 20paires de bases:
* G et C représentent le nombre de nucléotides,
* N est le nombre de bases de l'amorce.
LES ENZYMES (ADN polymérases thermostables)
L'amplification d'une séquence nucléotidique par la technique de la PCR utilise la réaction catalysée par les ADN polymérases en présence de plusieurs facteurs: ADN (matrice),la concentration en magnesium, les dNTP, les amorces (3'OH).
La Taq polymérase présente une activité maximale entre 70 et 75 °C. La fidélité de l'activité enzymatique dépend de trois caractéristiques spécifiques:
- la faculté de sélection des nucléotides.
- la discrimination entre les amorces correctement ou incorrectement appariées.
- la présence d'une activité exonucléasique 3'-5' associée, qui lui confère la capacité d'exciser un nucléotide incorrectement apparié en 3' d'une amorce.
Les ADN polymérases possèdent en présence de manganèse une activité transcriptase inverse très faible. Ceci permet l'utilisation d'une seule enzyme et évite les structures secondaires de l'ARN à des basses températures.
Seul inconvénient : la dégradation des ARN à haute température en présence de cations bivalents.
Les amplifications se font à partir de 80 pg d'ARN totaux, après chélatation du Manganèse et adjonction du Magnesium.
COFACTEURS
- La concentration des dNTP: elle doit être supérieure au Km des ADN polymérases Km= 10à 15µM pour la Taq polymérase.
- La concentration en Magnesium : la concentration optimale peut varier de 0,5à 5µM.
ROLE DU MgCl2
Il augmente la Td de l'ADN double brin et forme des complexes solubles avec les dNTP (substrat reconnu par les polymérases). Les valeurs utilisées en général sont 300 µM dNTP et 1-4 µM de MgCl2.
LE DMSO (Diméthyl Sulfoxyde)
il diminue les hybridations non spécifiques et déstabilise les structures secondaires de la matrice.
La Taq est inhibée par 10 % de DMSO.
LES CYCLES D'AMPLIFICATION
LA DENATURATION
La première dénaturation de l'ADN matrice est importante, la dénaturation partielle entraîne le self-priming (fausse positivité). La faible température rend l'accessibilité des amorces difficile et les temps de dénaturation très longs réduisent l'activité enzymatique (la demi-vie de l'enzyme est supérieure à 2heures à +92,5°C).
L'HYBRIDATION
La température et la durée de l'hybridation sont fonction de la composition, de la longueur et de la concentration des amorces. On considère comme valable une température inférieure de 5°C au plus à laTd la plus basse calculée pour chacune des deux amorces.
Un échantillon de PCR standard comporte:
- 1ng - 1µg d'ADN à amplifier
- 10 pmoles de chaque amorce
- 20 µM de chaque dNTP
- 10 µl de tampon 10X
- 2,5 U d'ADN polymérase
Le volume est complété à 100µl par de l'eau bidistillée et recouvert par 100µl d'huile minérale afin d'empêcher l'évaporation.
Les échantillons sont déposés dans l'appareil, où ils subissent une dénaturation de 7minutes avant de commencer le programme de 30cycles standard comportant chacun:
* une étape de dénaturation:
1 minute à + 94°C
* une étape d'hybridation:
X minutes à (Td - 5°)C
* une étape d'élongation:
Y minutes à + 72°C
L'amplification s'achève par une étape d'élongation de 10minutes à +72°C permettant ainsi de terminer l'élongation des produits en cours. Le dernier cycle consiste à maintenir l'échantillon à 4°C afin de stopper l'activité enzymatique (voir figureA)
L'AMPLIFICATION
Pour les ARN, une amplification par RT/PCR est nécessaire. La synthèse de l'ADN complémentaire est réalisée en ajoutant dans un tube contenant de l'ARN, les amorces, du tampon 10X, des dNTP 1 µM final, du DTT 0,1 M, 200 U/µl de volume final de transcriptase reverse, 20 U de RNAsine, le tout dans un volume de 20 µl. Le mélange est alors placé une heure à 42°C pour l'élongation.
- Réaction d'amplification :
- 0,5 µl de la Taq
- 8 µl de tampon
- la seconde amorce en 5'
Le volume final est complété à 100 µl avec de l'eau ultra-pure. Le mélange est recouvert d'une goutte d'huile minérale pour éviter une éventuelle évaporation.
Les tubes ainsi préparés sont directement placés dans la machine et soumis à un programme d'amplification.
- Contrôle de l'amplification
Une aliquote, représentant le dixième du volume récupéré en fin d'amplification est déposée sur un gel d'agarose à 2% coloré par le bromure d'éthidium dans un tampon d'électrophorèse.
Les produits de l'amplification sont visualisés sous fluorescence UV. Un marqueur de masse moléculaire permet d'apprécier la taille de ces produits.
LES VARIANTES DE LA PCR
La nested PCR (PCR nichée)
Ce sont des PCR successives destinées à amplifier spécifiquement une séquence, on réalise une première PCR puis une deuxième PCR sur les produits de la première pour augmenter le rapport de spécificité. Cette technique permet d'augmenter la sensibilité (102 -103 ) par rapport à la simple PCR et la spécificité et minimise les effets d'inhibition de la première PCR.
Les applications :
- détecter le VHB (Virus de l'Hépatite B) dans un sérum faiblement titré,
- détecter une cellule anormale parmi 105cellules,
- amplifier un fragment à partir de 3fg d'ADN initial.
A noter que les conditions réactionnelles de la première PCR sont moins strictes.
La PCR asymétrique
C'est l'amplification par PCR en présence d'une faible quantité d'une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20à 25premiers cycles, l'ADN double brin est généré, jusqu'à épuisement de l'amorce limitante et de l'ADN simple brin est produit pendant les 5à 10derniers cycles; Les rapports d'amorces utilisés sont de 50pmole/1-5pmoles/100µl (1-3pmoles simple brin après 30cycles).
La PCR-SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) (Polymorphisme de conformation simple-brin)
Le principe est une migration différentielle en fonction de la structure tertiaire de l'ADN. Elle permet la séparation de deux séquences simple-brin complémentaires par électrophorèse en gel de polyacrylamide non dénaturant. Méthode simple et sensible utilisant un gel d'acrylamide (5à 6%) non dénaturant avec 5à 10% de glycerol. Elle peut être utilisée pour détecter un très faible nombre de cellules affectées, avec des substitutions, insertions ou délétions sur une seule base. Elle a été utilisée pour rechercher des mutations dans le RB (gène du Rétinoblastome), La protéine p53, le CFTR (Mucoviscidose), ou le NF-1 (Neurofribromatose de type1) et de changements hautement polymorphes dans les séquences Alu.
La PCR-DGGE (Denaturing Gradiant Gel Electrophoresis)
L'électrophorèse en gel de gradiant dénaturant permet l'analyse d'un spectre de mutations ponctuelles induit par des carcinogènes sur des cellules humaines. Elle permet de séparer des séquences d'ADN ne se différenciant que par substitution, par délétion ou par addition. Par exemple, elle permet de différencier un fragment d'ADN sauvage de ses divers allèles mutés.
La migration d'ADN se fait dans un gel de polyacrylamide où il rencontre des concentrations croissantes d'agents dénaturants (urée+formamide), dont le rôle est de mimer une augmentation linéaire de la température du haut vers le bas du gel. La dissociation transforme le fragment d'ADN en une structure partiellement ouverte et crée une diminution brutale de sa mobilité, qui conduit l'ADN à se concentrer en un point du gel. La migration des molécules est de ce fait très dépendante de la séquence.
Cette méthode est souvent utilisée pour l'étude des mutations spontanées ou induites et les erreurs de polymérases.
La PCR ancrée
Décrite pour la première fois sous le nom d'amplification rapide d'extrémité d'ADNC ou RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Elle se pratique sur ARN en présence d'oligo dT.
D'autres PCR utilisent les séquences répétées du génome:
* L'Alu-PCR: elle utilise deux séquences répétées Alu proches d'environ1Kb
* Les microsatellites qui sont des répétitions de 10 à 30 fois formées de di, tri ou tetranucléotides. La PCR est réalisée en présence d'amorces des régions flanquantes et le contôle d'amplification sur un gel dénaturant.
* Les minisatellites, qui sont des motifs élémentaires plus longs (10 nucléotides avec un nombre de répétitions beaucoup plus important). Ces répétitions sont localisées dans la région télomérique et leur extrême variabilité permet leur utilisation en médecine légale.
Exemples d'applications de la PCR:
- diagnostic des hépatites (B,C etD), diagnostic des HIV,
- elle permet l'étude des anomalies cytogénétiques (translocations, délétions), des virus associés à l'oncogénèse lymphoïde dans les tumeurs hématopoïetiques, comme le HTLV I/II et l'EBV (différenciation entre la monoclonalité et la polyclonalité),
- étude des mutations ponctuelles par PCR-SSCP pour Ras et p53,
- étude de la méthylation des régions flanquantes des gènes par analyse de restriction,
- détection des évènements rares, tels la présence de 1 % de cellules tumorales ou la détection d'une faible quantité de cellules (10-4 10-5) après un traitement par chimiothérapie ou greffe de moelle.
En criminologie, la PCR est très utilisée pour détecter des polymorphismes sur de faibles quantités (1 µl de sang ou quelques cheveux).
Mr Kamal WAHBI