Avril 1998 - n°27

Protocole général pour la préparation de l'échantillon par extraction Solide-Liquide dans le domaine pharmaceutique (2^ème partie)

Mr Tisserand - Phase Séparations

La préparation de l'échantillon sur cartouche d'extraction SPE suit certaines étapes obligatoires qu'il est nécessaire de comprendre et de suivre. Cette deuxième partie est consacrée aux étapes de chargement et de lavage de l'échantillon (voir figure 1)

Chargement de l'échantillon

Il est important de prendre en compte les paramètres de capacité en masse et de capacité en volume de la cartouche d'extraction utilisée. En général, une cartouche de silice greffée de 200 mg de phase peut retenir de 1 à 5 mg de matériel alors qu'une cartouche de 500 mg peut retenir jusqu'à 10 mg de matériel. Il est nécessaire de connaître le k' de chacun des composés retenus afin d'évaluer l'affinité entre la cartouche et le composé à isoler. Plus le k' du composé sera grand, plus il sera possible de charger des quantités importantes sur l'échantillon.

La capacité en volume de charge sur la cartouche peut être également dépendante du k' du composé : si le k' est faible, le volume de l'échantillon chargé devra se situer entre 0.5 et 1 ml, si le k' est élevé, on pourra charger jusqu'à 10 ml d'échantillon sur une cartouche de 500 mg de phase C18.

Un point important est la vitesse de chargement de l'échantillon sur la cartouche, celle-ci ne doit pas excéder 2 ml/min. Un chargement manuel devra donc se faire très lentement pour s'assurer que l'échantillon entre bien en contact avec la phase de la cartouche. Une des causes du manque de reproductibilité vient souvent d'un chargement trop rapide de l'échantillon.

Pour ne utilisation de cartouche C18, il convient de s'assurer que le pH de l'échantillon dans lequel se trouve le ou les composé(s) à retenir favorise l'interaction entre les composés et la phase C18. En effet, comme le montre la figure 2, un composé sera plus retenu sur une cartouche C18 s'il se présente sous une forme neutre plutôt que sous une forme ionisée, ainsi à pH 7, l'acide salicylique est moins bien retenu sous la forme dissociée qu'à pH 12 sous une forme protonée donc neutre.

Lavage de l'échantillon

Cette étape est supposée débarrasser l'échantillon des interférences et conserver les composés d'intérêt sur la cartouche. Si vos composés sont très polaires, le lavage se fera avec 1 ml d'eau pure, si vos composés sont fortement accrochés au support C8, il est plus avantageux de laver l'échantillon avec 1 ml de 5 % de méthanol dans l'eau. Lorsque l'échantillon est un sérum ou un plasma, en utilisant 1 ml de 5% de méthanol dans l'eau, on élimine toute l'albumine, les globulines, les lipides, les sels et les carbohydrates. De plus, le méthanol minimise la turbidité causée par les protéines du plasma.

Dans l'exemple de la figure 3, on comprend que plus les composés sont polaires (paraxanthine, théophylline), moins ils ont d'affinité avec la phase C18, il est donc déconseillé d'utiliser 5% de méthanol dans l'eau pour laver l'échantillon, car on risque de perdre au lavage une grande partie des composés d'intérêt.

La troisième partie du protocole traitera de l'élution et de la reconstitution de l'échantillon avant l'analyse.