Décembre 1998 - n°33

Les perspectives de la biologie moléculaire
par Claude MABILAT - bioMérieux - Lyon

La logique du diagnostic moléculaire:

Les techniques de biologie moléculaire existent en recherche depuis de nombreuses années. En plus d'un outil fondamental pour la connaissance, elles revêtent une valeur diagnostique certaine. En fait, cette valeur est constituée par la séquence nucléotidique elle-même.

C'est bien l'enchaînement spécifique des quatre nucléotides qui se révèle être la signature d'un marqueur génétique de différenciation d'espèces, de souches, de facteurs de virulence, de résistance aux antibiotiques ou aux antiviraux, etc.

Ainsi la connaissance des séquences nucléotidiques est le préalable indispensable à la conception d'un test de diagnostic moléculaire.

Cette nécessité a entraîné entre autres une croissance exponentielle des banques de séquences publiques et privées (EMBL, GenBank, TIGR et autres banques des sociétés thérapeutiques ou diagnostiques) depuis une dizaine d'années. Les outils de traitement de l'information suivent la même tendance (accès ENTREZ et MEDLINE disponibles pour tous sur Intemet).

Après l'information, la technologie :

Le fromage que je consomme contient-il des Listeria monocytogenes ? Comment tester l'absence ou la présence de l'information recherchée dans le prélèvement ?

L'accès aux séquences cibles au sein des prélèvements cliniques, alimentaires ou environnementaux se fait à l'aide de différentes techniques selon le niveau d'information requis : sonde d'hybridation oligonucléotide, gel-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) ou séquençage enzymatique sur gel selon Sanger pour appréhender les variations de séquences au sein d'un marqueur polymorphique.

La recherche de type quantitative aura pour but de prédire le nombre de cibles initiales dans le prélèvement à travers la succession des étapes d'extraction-purification des acides nucléiques, d'amplification enzymatique, de détection-hybridation qui se veulent aussi linéaires ou constantes que possible.

Bien qu'ils tardent à se généraliser en routine les avantages des kits sondes nucléiques restent conséquents et justifient la constance des investissements de recherches publiques et industrielles dans ce domaine : rapidité grâce à l'amplification de cible, robustesse grâce à la redondance de l'information collectée, résolution supérieure par rapport à l'approche phénotypique, aspect irremplaçable dans certains cas.

bioMérieux concrétisent ces concepts à travers 2 projets sondes :

- Le VIDAS avec des tests unitaires de screening.

- ANAIS utilisant la technologie des puces Affymetrix.

Les "Puces à ADN"

Sous ce terme générique est désigné une évolution de la technique d'hybridation "reverse dot-blot" visant à analyser des acides naturels ou amplifiés.

Comme leur nom l'indique, il s'agit de surfaces planes, en général très petites (moins de 1 cm2) portant des sondes ADN oligonucléotidiques.

Il s'agit d'une évolution technologique fantastique combinant le savoir-faire de la chimie des acides nucléiques et des industries électroniques et informatiques. Les techniques de jets d'encre ou de masques à haute résolution (10 à 100 µm) sont utilisés pour distribuer respectivement les oligonucléotides synthétisés ou les réactifs de synthèse des oligonucléotides. Cette deuxième technique permet d'effectuer la synthèse des oligonucléotides directement sur le support diagnostic. Elle est la spécialité d'Affymetrix (société avec laquelle bioMérieux a récemment signé un accord d'exclusivité en bactériologie clinique).

La fabrication des puces ADN et leur exploitation requièrent l'intégration de savoir-faire dans des domaines très divers : chimie pour la synthèse et l'immobilisation des oligonucléotides, biophysique et biochimie pour contrôler l'adsorption et la spécificité d'hybridation, microfabrication, biologie moléculaire pour la préparation de l'amplicon à hybrider (fragmentation et marquage), micro-optique pour la collecte du signal, bioinformatique pour la reconstruction de séquences ou de profils et leur traitement, etc.

Les différentes stratégies de typage d'acides nucléiques

L'un des aspects les plus remarquables des puces est le grand nombre de séquences différentes testées au cours d'une seule hybridation (unité de temps, de lieu et de conditions opératoires), typiquement de quelques centaines à plusieurs milliers. Ce "parallélisme" entraîne un changement d'échelle tel qu'il constitue une véritable révolution en permettant des applications impossibles auparavant. Pour typer un ou des amplicons issus d'un ou de plusieurs marqueurs d'intérêt, plusieurs stratégies existent désormais : utilisation de sondes spécifiques, l'expression différentielle de gènes, la génération de profils spécifiques, séquençage par hybridation. Les applications potentielles des puces à ADN seront détaillées au cours de l'exposé.