Mars 1999 - n°36

Puces à ADN : un nouvel outil technologique au service de la santé publique

Un nouvel outil technologique miniaturisé, baptisé puce à ADN (DNA chip), a récemment attiré l'attention de la communauté scientifique du fait de son immense potentiel en matière de diagnostic biologique, de recherche de mutations génétiques et de développement de nouveaux médicaments. Les secteurs de l'agroalimentaire et de l'environnement devraient également être rapidement concernés.

Née du mariage de la microélectronique, de la biochimie, de la chimie combinatoire, de la biologie moléculaire, de l'informatique et de l'analyse d'image, la puce à ADN ou biopuce, permet d'analyser simultanément plusieurs milliers d'informations génétiques différentes. Grâce à ce nouvel outil, il est possible en parallèle d'identifier, et même de doser, un nombre considérable de séquences d'ADN contenues dans un échantillon biologique (sang, biopsie, mais aussi eau, aliments, etc.).

L'acide désoxyribonucléique ...

L'ADN se présente sous la forme d'une échelle de deux brins enroulés en double hélice. Chaque montant de cette échelle spiralée est formé par l'une des quatre lettres (ou bases) qui composent l'alphabet génétique (A, T, C, G).

Le fonctionnement d'une puce à ADN repose sur la réaction d'hybridation, selon laquelle la base A portée par un brin d'ADN s'unit en face, sur l'autre brin, à la base T qui lui est complémentaire. Et réciproquement. Même chose pour les bases C et G. C'est le fondement de la biologie moléculaire et de la génétique.

La puce ...

Les puces à ADN sont constituées d'une surface de verre d'environ 1cm2, sur laquelle on peut greffer jusqu'à 400 000 brins d'ADN (ou oligonucléotides). Les bases qui composent ces sondes oligonucléotidiques ont été synthétisées directement sur le verre (synthèse in situ) selon une technique issue de la microélectronique qui s'apparente à celle de la gravure. Cette technique repose sur la protection ou l'exposition à la lumière, par un jeu de pochoirs, de zones définies de la puce, afin d'activer les groupements chimiques photosensibles désirés (c'est-à-dire les empilements de bases A, T, C, G, dans l'ordre choisi). Par conséquent, l'emplacement des différentes sondes sur la puce et l'enchaînement des bases qui les composent sont très précisément connus.

La réaction ...

Lors d'une analyse, on cherche à détecter des fragments de matériel génétique (ADN ou ARN cibles) contenus dans un échantillon biologique. L'ADN à analyser peut être celui des cellules d'un patient ou bien celui d'un microorganisme infectieux.

On va d'abord procéder à la copie en de multiples exemplaires des séquences génétiques recherchées dans cet échantillon. Ce processus d'amplification est nécessaire pour pouvoir disposer du matériel génétique en quantité suffisante en vue de sa détection ultérieure par la puce. Une fois amplifié, l'ADN est marqué (par fluorescence).

Il peut alors être déposé sur la puce. La présence de l'ADN cible dans l'échantillon est révélée par son hybridation (figure 1) avec la sonde qui lui est complémentaire sur la puce.

Il s'agit ensuite, en mesurant la fluorescence, de repérer les sondes qui ont effectivement réagi avec l'ADN marqué contenu dans l'échantillon testé. La lecture de la puce nécessite des méthodes optiques sophistiquées (balayage laser, caméra, etc.), couplées à un traitement informatique de l'image.

Diverses applications en développement :

I - Une puce à ADN pour mieux contrôler la qualité de l'eau potable
Partenariat industriel Lyonnaise des Eaux / bioMérieux

Lyonnaise des Eaux et bioMérieux ont décidé d'unir leurs compétences pour mettre au point, dans le cadre d'un programme de recherche commun, une nouvelle technique d'analyse de l'eau potable. Totalement inédite, elle utilisera un procédé de haute technologie : la puce à ADN. Plus précis, plus rapide et moins coûteux que les techniques actuelles, ce nouveau procédé apportera aux consommateurs une garantie renforcée en matière de contrôle de la qualité de l'eau.

Une technologie plus précise

La puce à ADN permettra d'identifier de manière précise tout microorganisme recherché dans l'eau en le reconnaissant à travers son empreinte génétique. Il deviendra plus facile de prendre des mesures adaptées en matière de traitement de l'eau. De surcroît, la puce à ADN devrait permettre de détecter des concentrations plus faibles que celle détectées par les techniques actuelles. Elle offre ainsi la possibilité de surveiller la qualité de l'eau au-delà de ce que la réglementation actuelle impose. C'est donc une garantie supplémentaire qui sera offerte aux consommateurs.

Une technologie plus rapide

Avec la puce à ADN, les résultats des analyses seront donnés en moins de 4 heures. Cette rapidité présente deux avantages majeurs. Premièrement plus un incident est détecté rapidement, plus vite les traitements adéquats sont mis en oeuvre. Deuxièmement, plus vite on rétablit le service de l'eau potable, moins on pénalise les consommateurs, particuliers ou industriels.

Une technologie moins coûteuse

Aujourd'hui, l'identification de chaque microorganisme recherché nécessite une analyse spécifique. Une seule puce peut identifier, en une seule fois, plusieurs dizaines de microorganismes. Les économies d'échelle deviennent alors très importantes. Actuellement avec les techniques classiques une analyse microbiologique complète (24 critères) coûte, au total, environ 20 000 Francs. Les premières évaluations montrent que, une fois sur le marché, l'analyse par puce à ADN pourrait coûter 10 fois moins cher.

Un saut technologique important

La technologie des puces à ADN est une découverte très récente qui constitue incontestablement un saut technologique. C'est un outil intégrant la biologie moléculaire, la microélectronique, la chimie, l'analyse d'image et la bio informatique. Elle ouvre une nouvelle ère dans l'analyse de l'eau.

Contrairement aux méthodes traditionnelles d'identification qui étudient les caractères morphologiques et physiologiques des microorganismes, l'identification moléculaire repose sur le principe de la reconnaissance d'une ou plusieurs séquences nucléiques contenues dans les molécules d'ADN ou d'ARN présentes dans tout organisme vivant.

La puce est constituée d'un support miniaturisé (1 cm2) sur lequel sont greffées plusieurs dizaines de milliers de sondes ADN. Ces sondes sont capables de reconnaître les brins d'ADN qui leur sont complémentaires, présents dans l'échantillon d'eau analysé, et de se fixer à eux par hybridation. L'analyse de la surface de la puce par un rayon laser permet le repérage des hybridations grâce aux signaux émis par des marqueurs fluorescents. Une empreinte d'hybridation est alors signalée. Le traitement informatique de cette empreinte permettra de déterminer la présence et l'identité des microorganismes recherchés dans l'échantillon.

Le partenariat

L'association de Lyonnaise des Eaux et bioMérieux, leaders mondiaux dans leur domaine d'activité, est une coopération de recherche industrielle originale. Elle permet à Lyonnaise des Eaux de bénéficier de l'avance de la technologie d'Affymétrix, spécialiste mondial des puces à ADN (GeneChip®) et partenaire de bioMérieux. Lyonnaise des Eaux accède à l'ensemble du savoir-faire de bioMérieux dans le domaine des puces et des sondes ADN. Le budget total de ce partenariat s'élève à 8,5 millions d'euros (55 millions de francs).

Une équipe de recherche commune pluridisciplinaire a été constituée et utilise les infrastructures et les compétences des partenaires : le centre de recherche de Lyonnaise des Eaux, situé au Pecq, en banlieue parisienne et le centre de recherche de bioMérieux situé à Lyon - Moulin à Vent.

II - Puces à ADN : une nouvelle approche pour le génotypage des mycobactéries

Santa Clara CA (Etats-Unis) - Marcy-l'Etoile (France) - 11 Janvier 1999 - Dans le numéro de janvier 1999 de Journal of Clinical Microbiology, Alain Troesch (bioMérieux) et coll.1 démontrent pour la première fois qu'il est possible, grâce à une puce à ADN à haute densité (GeneChip®), de typer génétiquement (génotypage) toutes les espèces de mycobactéries d'intérêt clinique, incluant les espèces du complexe de M. tuberculosis, et les mycobactéries atypiques.

Identifier les espèces et déterminer leur profil de résistance

Le genre Mycobacterium regroupe environ 80 espèces et sous-espèces de bactéries. Parmi les espèces pathogènes, une dizaine sont responsables de 90 % des mycobactérioses rencontrées chez l'homme. La tuberculose est la principale de ces pathologies. Elle est due aux espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis et M. africanum). Les autres pathologies résultent d'infections opportunistes, particulièrement chez le sujet immunodéprimé, impliquant au total plus d'une dizaine de mycobactéries dites atypiques. Il s'agit de M. xenopi et M. kansasii responsables d'atteintes pulmonaires, ganglionnaires, ostéoarticulaires, cutanées et sous-cutanées, et d'espèces du complexe Mycobacterium avium-intracellulare, responsables d'infections généralisées chez les patients atteints du sida.

Dans les travaux qu'ils rapportent, Troesch et coll. sont parvenus, en utilisant une même puce à ADN, GeneChip®, à répondre simultanément à deux questions du diagnostic biologique des infections à mycobactéries : l'identification de l'espèce, et son profil de résistance à la rifampicine (l'antibiotique de référence de la trithérapie recommandée en première intention pour le traitement de la tuberculose). Dans le contexte de l'émergence de souches multirésistantes, les réponses à ces questions sont devenues cruciales pour la mise en oeuvre immédiate d'un traitement adapté.

L'identification des espèces de mycobactéries repose sur le génotypage d'une région du génome bactérien présentant un fort polymorphisme, la région de l'ARN ribosomal 16S. Cette région, utilisée dans plusieurs tests de diagnostic moléculaire déjà commercialisés, est considérée comme “l'étalon or” de la spécificité d'espèces pour les mycobactéries, et son analyse permet d'en retrouver la signature.

Une approche similaire permet de définir le profil de résistance à la rifampicine des espèces du complexe M. tuberculosis. On sait en effet, que dans 90 % des cas, cette résistance est conférée par des mutations très localisées, situées dans la région du gène codant pour une ARN-polymérase bactérienne, le gène rpoB.

Troesch et coll. ont amplifié ces deux régions à partir d'isolats référencés de mycobactéries. Les produits d'amplification ont ensuite été marqués par fluorescence, puis hybridés à des sondes oligonucléotidiques spécifiques de l'une ou l'autre de ces régions présentées à la surface de la puce GeneChip®. Ces sondes, que les auteurs ont disposées sur la puce suivant une répartition ordonnée, sont identifiées d'après leur position.
Une fiabilité de 100 % pour chacune des réponses cherchées a été obtenue par cette approche méthodologique. Soixante-dix souches représentant 27 espèces de mycobactéries d'intérêt clinique, ont été testées. Les séquences de toutes ces espèces ont été correctement identifiées. Par ailleurs, parmi les souches de M. tuberculosis testées, les 15 souches résistantes à la rifampicine ont été reconnues comme telles.
L'étude confirme également le pouvoir hautement résolutif du GeneChip®. Les résistances liées à des mutations ponctuelles (n'impliquant qu'un seul nucléotide) ont été détectées, aussi bien que celles impliquant un nombre plus élevé de nucléotides.

Une technologie à haute résolution

La technique du DNAchip a été développée par Fodor et coll.2&3 à Affymetrix, Inc.(NASDAQ : AFFX). Elle permet de produire une “biopuce”, destinée à identifier des fragments d'ADN ou d'ARN marqués par fluorescence, grâce à leur hybridation avec de courtes séquences d'ADN, les sondes oligonucléotidiques. Dans le cas de la puce à ADN (GeneChip®), développée par Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX), les sondes oligonucléotidiques sont synthétisées in situ, par une technique alliant synthèse chimique sur support solide et photolithographie. Cette technique, issue de la microélectronique s'apparente à celle de la gravure. Elle repose sur la protection ou l'exposition à la lumière, par un jeu de pochoirs, de zones définies de la puce afin de rendre réactifs les groupements chimiques photosensibles désirés.
Le support, une surface de verre d'environ 1 cm2, constitue l'unité d'hybridation. Chaque unité d'hybridation peut contenir un nombre très élevé de sondes oligonucléotidiques uniques (jusqu'à 400 000), autorisant le traitement de plusieurs marqueurs en parallèle. Pour chaque marqueur, toutes les possibilités de séquence sont représentées sur la puce, une seule d'entre elles devant être rendue positive par l'échantillon à tester.
La positivité est détectée par l'intensité de la fluorescence, proportionnelle au degré d'hybridation entre la sonde et la séquence cible, et chaque sonde est identifiée d'après sa position sur la puce. Ainsi, parmi les séquences positionnées sur la puce conçue par Troesch et coll., 2 marqueurs sont représentés : un marqueur d'espèce (la région de l'ARN ribosomal 16S), et un marqueur de résistance à la rifampicine (la région du gène rpoB).

Plusieurs réponses en une seule puce

Le diagnostic d'une infection à mycobactéries repose sur deux approches : l'approche traditionnelle par examen microscopique du prélèvement, culture bactérienne puis identification des métabolites de la bactérie, et l'approche moléculaire, par reconnaissance de la signature génétique des microorganismes.
L'approche traditionnelle qui était jusqu'à récemment, la seule méthode disponible, comporte un inconvénient majeur : pour certaines espèces de mycobactéries, 3 à 4 semaines de délai sont nécessaires afin d'obtenir un résultat.
Elle est de ce fait peu à peu supplantée par les méthodes moléculaires qui consistent à identifier les mycobactéries par génotypage. Plusieurs tests de ce type ont été récemment mis sur le marché. Produisant un résultat en 4 ou 5 heures, ces tests autorisent une réduction considérable du délai de mise en oeuvre d'un traitement adapté et d'isolement éventuel du patient. Ils peuvent être réalisés directement à partir de l'échantillon biologique dans les cas où l'examen microscopique est positif (quantité suffisante de bactéries dans l'échantillon). Quand cet examen est négatif, les méthodes génotypiques nécessitent, au préalable, de réaliser une amplification par culture du matériel biologique ou une amplification enzymatique du matériel génétique.

La technique de GeneChip® ne se contente pas d'accélérer le diagnostic. Elle apporte deux avantages supplémentaires au regard des autres techniques moléculaires : son pouvoir résolutif et le traitement en parallèle de plusieurs questions diagnostiques. Son pouvoir hautement résolutif permet de distinguer un bien plus grand nombre d'espèces de mycobactéries pathogènes chez l'homme, contrairement aux autres tests moléculaires, qui n'identifient que les plus fréquentes. Or l'émergence de mycobactéries atypiques responsables d'infections opportunistes rend nécessaire l'identification précise de chaque espèce. Elle permettra non seulement d'améliorer la prise en charge thérapeutique de ces infections, mais aussi d'améliorer la connaissance épidémiologique des mycobactéries atypiques, et en particulier leur répartition dans l'environnement.

Grâce aux possibilités offertes par la puce, il est envisageable de multiplier les réponses diagnostiques. En particulier, il est prévu d'intégrer sur la puce, des marqueurs de la résistance à d'autres antibiotiques, dont les bases moléculaires se précisent peu à peu.

Ainsi, la résistance à l'isoniazide a été récemment associée à des mutations dans les gènes de la catalase-peroxidase (KatG), dans les promoteurs des gènes inhA et ahpC, et dans le gène de la protéine kas A. De même, la résistance à la pyrazinamide semble associée à des mutations du gène pncA et, la résistance à l'éthambutol, au gène emb.

Les accords entre bioMérieux et Affymetrix portent leurs fruits

Les résultats de Troesch et coll. marquent une étape importante dans la réalisation des objectifs que se sont fixés Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX) et bioMérieux aux termes de leur accord de collaboration.

Cet accord signé le 21 octobre 1996 et élargi le 21 janvier 1998 prévoit le développement de tests de diagnostic fondés sur la technique du GeneChip® développée par Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX).

Il devrait aboutir à la commercialisation par biomérieux d'un système de diagnostic complètement automatisé. Le principal domaine ciblé est la bactériologie infectieuse qui fait l'objet d'un accord exclusif. Deux autres domaines sont également concernés :
le génotypage des souches du VIH résistantes aux thérapies antirétrovirales, et celui des agents microbiens de contamination dans le domaine alimentaire et cosmétique.
Le projet Anaïs® de bioMérieux, issu de cet accord, donnera à court terme, le jour à deux réactifs : une puce à ADN pour l'identification des mycobactéries (espèce et profil de résistance à la rifampicine), et une puce à ADN pour le génotypage du VIH.
A long terme, ces réactifs devraient faire partie d'un système complètement automatisé de diagnostic des maladies infectieuses, intégrant toutes les étapes de la procédure, depuis la préparation de l'échantillon jusqu'au rendu des résultats. Le projet prévoit également l'extension du menu à d'autres marqueurs, de telle sorte que face à une situation pathologique donnée (infections respiratoires, infections génitales, etc.), un seul test GeneChip® suffise pour identifier l'agent pathogène en cause (bactérie, virus, levure ou parasite), à la fois en terme d'espèce et en terme de résistance aux traitements.

Références :

1. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gingeras TR, Kaplan PM, et al. Mycobacterium Species Identification and TB Rifampin Resistance Testing with HighDensity DNA Probe Arrays. J Clin Microbiol 1999.
2. Lipshutz RJ, Morris D, Chee M, Hubbell E, Kozal MJ, Shah N, et al. Using oligonucleotide probe arrays to access genetic diversity. BioTechniques 1995 ; 19 :442-447.
3. Fodor SPA, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991 ; 251:767-773.

III - Autres applications
d’aujourd’hui et de demain

Les domaines d'applications des puces à ADN ou à ARN sont nombreux et variés.

Agroalimentaire / Environnement

Dans une chaîne de production agroalimentaire, les puces à ADN sont des outils particulièrement efficaces pour reconnaître l'origine des espèces animales qui composent les produits alimentaires, mais également pour détecter et contrôler dans des semences des séquences provenant d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Les applications dans l'environnement seront l'analyse microbiologique de l'eau de consommation, et plus généralement le contrôle qualité en milieu industriel, pour renforcer la sécurité des procédés et des produits.

Analyse de l'expression des gènes

Les puces à ARN se révèlent être des outils remarquables pour analyser le fonctionnement des gènes (niveau d'expression) dans certains tissus sains ou pathologiques, en particulier pour déterminer ceux qui sont spécifiquement actifs dans certaines cellules. Les puces ont déjà permis d'identifier de nouveaux gènes dont certains sont associés à des maladies inflammatoires rhumatismales et digestives.

Analyse de mutations génétiques

La génétique médicale est un des grands secteurs concerné par les puces à ADN. De tels outils ont notamment été développés pour identifier des mutations génétiques.

Diagnostic biologique de maladies infectieuses et recherche de résistances

La société bioMérieux développe des puces porteuses de sondes ADN propres à certains germes pathogènes. Elles sont conçues pour la détection de bactéries ou virus responsables d'infections notamment respiratoires et génitales.
Porteuse de sondes correspondant à certaines régions du génome de certains virus, la puce à ADN permet la détection rapide et simultanée de mutations qui confèrent à ces virus une résistance vis-à-vis de plusieurs catégories d'antirétroviraux. Ces puces pourraient considérablement aider les cliniciens à adapter le traitement antiviral de leurs patients.
La puce à ADN est également capable de renseigner sur la présence, dans le génome de certaines bactéries, de mutations génétiques associées à des résistances à des antibiotiques. Ici encore, elle permet de prescrire très rapidement un traitement adapté.

Recherche pharmaceutique

Découverte de nouveaux médicaments
La mise au point de nouveaux médicaments par une approche rationnelle passe par l'identification des gènes qui participent aux mécanismes moléculaires fondamentaux associés aux grandes pathologies.
Or, les puces à ARN permettent justement de détecter quels sont les gènes spécifiquement actifs dans les tissus malades. Elles sont donc d'une aide précieuse pour identifier les gènes étroitement associés aux processus physiopathologiques.
Ces gènes et les protéines qui leur correspondent sont autant de cibles thérapeutiques potentielles sur lesquelles les chercheurs de l'industrie pharmaceutique peuvent ensuite concentrer leur effort.

Une meilleure connaissance du métabolisme des médicaments
Mieux comprendre l'action des médicaments
Les puces à ADN permettent de déterminer quels sont les gènes dont l'activité est modulée dans une cellule sous l'action d'un médicament. Il devient ainsi possible de faire l'inventaire des gènes dont le fonctionnement est influencé par un produit, et donc d'avoir une vision plus complète de son action.
Mieux comprendre la panoplie des effets moléculaires générés par un médicament peut déboucher sur de nouvelles pistes pharmacologiques, jusque là insoupçonnées.

Identifier rapidement de possibles effets secondaires
Les puces à ADN permettent, parfois bien avant la réalisation des premiers essais cliniques, de déterminer qu'un produit pharmaceutique en cours de développement perturbe grandement l'activité de gènes essentiels à la bonne marche de la cellule ou l'intégrité d'une fonction physiologique essentielle. Dans ces cas, il est possible de prédire la nature des effets secondaires ou toxiques qui pourraient être associés à l'emploi de la molécule.

S'adapter au profil de chaque individu
La vitesse à laquelle de nombreux médicaments sont dégradés dans l'organisme dépend d'un ensemble d'enzymes présents dans le foie (système des cytochromes P450). D'une personne à l'autre, on constate des variations génétiques ou encore des différences dans le niveau d'expression des gènes qui gouvernent la synthèse de ces enzymes hépatiques.
Ceci explique les différences observées entre patients dans leur réponse individuelle aux médicaments. On a ainsi recensé plus d'une quinzaine de variations génétiques (polymorphismes). Des puces à ADN ont été développées qui permettent de détecter ces polymorphismes et de quantifier le niveau d'expression des gènes.

Grâce aux puces à ADN, la connaissance de ces polymorphismes génétiques permettra de mieux ajuster les doses des traitements en fonction du profil génétique de chaque patient.

Séquençage

Utilisés sur des fragments d'ADN issus de génomes bactériens ou de levures par exemple, les puces à ADN permettent de vérifier la séquence (reséquençage) de régions de certains gènes d'intérêt.