Octobre 2004 - n°92
La Triple Détection en chromatographie d’exclusion stérique pour caractériser les polymères, les macromolécules, et les protéines
par Sandrine Olivier de Viscotek Europe Agence Francophone
La chromatographie d’exclusion stérique ou à
perméation de gel (GPC/SEC ou CES) fait partie des techniques analytiques
les plus courantes du laboratoire en caractérisation de polymères.
Cette technique chromatographique sépare l’échantillon
de polymère en fractions en fonction de son volume hydrodynamique.
Grâce à un détecteur de concentration, souvent un réfractomètre,
on établit pour cet échantillon un graphe représentant
la fraction massique en fonction du volume d’élution. La manière
d’exploiter ce chromatogramme de concentration en données utiles
repose au cœur de la GPC.
En GPC conventionnelle, des polymères standards sont analysés
et utilisés tels des marqueurs de masse moléculaire afin de
calculer une distribution de masse relative pour l’échantillon.
Cette approche a l’avantage d’être relativement simple,
avec le minimum d’équipement, mais a le désavantage important
de donner uniquement des valeurs de masse relative, affectées par la
nature chimique et la structure du polymère (linéaire, branché…).
La GPC Triple Détection, ou SEC3, est un des progrès les plus
significatifs de cette technique depuis ses débuts dans les années
60. La Triple Détection a transformé les capacités de
la GPC, d’une méthode mesurant uniquement la masse moléculaire
relative du polymère en un outil complet de caractérisation
du polymère.
En GPC Triple Détection, 2 autres détecteurs sont ajoutés
au détecteur de concentration : un détecteur de diffusion de
lumière (statique) et un viscosimètre. Chaque détecteur
apporte une information indépendante qui est exploitée en Triple
Détection pour déterminer avec exactitude la masse moléculaire,
la taille moléculaire et la viscosité intrinsèque sur
toute la distribution du polymère. Nous allons expliquer comment ces
informations sont obtenues et pourquoi la Triple Détection est un outil
si complet et à fort potentiel.
Mesure de la masse moléculaire par détecteur
de diffusion de lumière statique (DdL)
En analyse GPC de routine, essentiellement 2 approches, par extrapolation
ou par calcul,étaient utilisées pour convertir le signal du
détecteur en masse moléculaire vraie (ou " absolue ").
En effet, l’intensité de la lumière diffuse est fonction
de la masse du polymère mais aussi de l’angle de mesure. Cette
dépendance angulaire de la lumière diffuse est une fonction
non linéaire, croissant avec la taille moléculaire. Aux très
petits angles de mesure (<10°), cette dépendance angulaire n’est
pas observée.
Aujourd’hui, un détecteur novateur à angle de mesure à
7° du faisceau incident (Low Angle Light Scattering ou LALS) permet de
réaliser la mesure facilement et de la convertir en masse moléculaire
directement sans extrapolation ni calcul. La terminologie d’ "
absolue " peut être utilisée plus correctement dans le cas
du LALS où il n’y a ni extrapolation, ni calcul pour aboutir
à la masse.
Mesure de la viscosité intrinsèque
Même si plus difficile à comprendre, le paramètre de viscosité
intrinsèque est aussi important que la masse moléculaire dans
la description de la molécule de polymère. L’unité
est le dl/g, montrant qu’il s’agit d’une mesure volumétrique.
En pratique, la viscosité intrinsèque est liée à
l’inverse de la densité du polymère en solution. Un polymère
enroulé de façon très compacte, telle une protéine
native, aura une forte densité en solution, et donc une faible viscosité
intrinsèque. A l’inverse, pour une masse moléculaire donnée,
un polymère synthétique classique avec une structure de type
bobine aura une viscosité intrinsèque 10 fois plus élevée
qu’une protéine.
De nombreuses modifications structurales ou de conformation transparaissent
dans la valeur de viscosité intrinsèque. Celles-là incluent
les ramifications et agrégats. Il en résulte que si les variations
de viscosité intrinsèque peuvent être mesurées
alors ces modifications structurales et de conformation peuvent être
étudiées voire quantifiées.
Détermination de la taille moléculaire
La connaissance de la taille moléculaire du polymère en solution
est une information clé pour les polymères synthétique
ou naturel. Deux types de mesure sont couramment utilisées : rayon
de giration (Rg) et rayon hydrodynamique (Rh). Les 2 peuvent être obtenus
en GPC de façon plus ou moins exacte suivant la méthode utilisée.
Tandis que Rg est assimilé à un moment mathématique,
Rh est basé sur une mesure réelle du volume occupé en
solution, et peut être déterminé avec exactitude sans
limite inférieure par GPC Triple Détection. Rh est calculé
à partir du produit de la masse moléculaire et de la viscosité
intrinsèque, chacuneétant obtenue avec exactitude par le LALS
et le viscosimètre.
Exemple d’analyse structurale
Dans la mesure où les valeurs de viscosité intrinsèque
et de masse moléculaire sont obtenues sur toute la distribution du
polymère,
les résultats peuvent être exploités pour étudier
la structure moléculaire du polymère. L’étude du
branching de polycarbonates va illustrer cela.
Les polycarbonates sont des polymères techniques aux propriétés
particulières comme la transparence, une forte rigidité, ou
une résistance aux radiation utilisés dans de nombreuses applications
dont en électronique et dans l’industrie automobile. Ils ont
des masses s’échelonnant de 10kDa 200kDa avec des degrés
de branching variables. Le degré de branching ayant une influence sur
les propriétés finales du matériau, l’analyse et
le contrôle minutieux de ce branching est très important.
Deux échantillons de polycarbonates (PC1 et PC2) dont l’un linéaire,
l’autre faiblement ramifié, ont été analysés
par GPC Triple Détection afin de quantifier le taux de ramification.
Les distributions en masse des 2 polycarbonates montraient des différences
en masse mais n’informaient aucunement sur les différences de
structure. Pour étudier la structure, le diagramme de Mark-Houwink
est utilisé . Ce diagramme qui représente la viscosité
intrinsèque en fonction de la masse montre clairement une différence
entre les 2 polycarbonates due au branching. L’échantillon PC1
étant en dessous de celui de PC2, sa densité est plus importante
que le PC2 (linéaire) quelle que soit la masse. Le nombre de ramifications
sur la distribution est calculé grâce aux rapports des valeurs
de viscosité intrinsèque pour les 2 échantillons.
Même si cette information est intéressante et utile, l’augmentation
du nombre de branches avec la masse moléculaire pouvaitêtre intuitivement
prévisible. Pour observer l’évolution du nombre de ramifications
en fonction de la masse du polymère, il est plus appropriée
de déterminer la fréquence de ramification. Dans le cas de ces
2 polycarbonates, la fréquence de ramification, exprimée ici
en nombre de branches par 100 000 Da, diminue avec l’augmentation de
la masse moléculaire c’est à dire plus la chaîne
est longue, plus la fréquence de branches le long du squelette du polycarbonate
est faible.Cette fréquence peut être reliée à la
synthèse et chimie de polymérisation. Ce cas est très
différent des polyéthylènes par exemple, pour lesquels
en général, la fréquence de ramification augmente avec
la longueur de chaîne.
Cette étude des polycarbonates démontre que l’extrême
sensibilité de la GPC Triple Détection a permis de détecter
et même quantifier de faibles taux de ramification dans le polycarbonate.
Conclusion
La technique de GPC Triple Détection possède plusieurs avantages
par rapportà la GPC conventionnelle, et même tout autre forme
de GPC. L’ajout d’un viscosimètre et d’un détecteur
de diffusion de lumière transforme le potentiel de la GPC en un outil
analytique de caractérisation très pointu. La masse moléculaire
est mesurée directement par le LALS ; la structure et les ramifications
grâce au viscosimètre. Les différences de structure et
de branching peuvent être détectées, quantifiées
et associées aux propriétés du produit fini. Ni la diffusion
de lumière ni le viscosimètre, ne pourraient faire ces mesures
seuls. C’est la combinaison des détecteurs qui rend la GPC Triple
Détection aussi complète.
La technique de GPC Triple Détection s’applique à tous
les polymères et macromolécules synthétiques ou naturels,
incluant les protéines et autres glycoconjugués.