Octobre 2006 - n°114
Sélection in vitro d’aptamères
dirigés contre des structures ARN et des protéines
Fanny Vella, Laetitia Evadé, Jean-Jacques Toulmé
et Eric Dausse
INSERM U386, Institut Européen de Chimie et Biologie
Des séquences ARN et ADN qui interagissent avec des cibles cellulaires
(protéines ou ARN) peuvent être des outils utiles afin d’explorer
les fonctions de l’ARN et des protéines dans différents
types d’études, notamment dans la régulation de l’expression
des gènes impliqués dans des processus pathologiques. Certaines
de ces molécules inhibent particulièrement les fonctions biologiques
des cibles et constituent, par conséquent, des candidats thérapeutiques
potentiels pour le traitement de certaines maladies telles que des maladies
virales humaines provoquées par le virus de l’immunodéficience
humaine [par exemple, Darfeuille et al. 2004; Chaloin et al. 2005; Dausse
et al. 2005; revu par Zhang et al. 2004] et le virus de l’hépatite
C [par exemple, Aldaz-Carroll et al. 2002; Toulmé et al. 2003].
L’identification de séquences présentant une forte affinité
pour des protéines d’intérêt diagnostique peut s’effectuer
par la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential
enrichment). Cette technique de sélection in vitro consiste à
rechercher des séquences dans une banque d’oligonucléotides
aléatoires (en général, environ 1015 espèces différentes).
Cette méthode comprend différentes étapes dont l’incubation
d’ARN ou d’ADN aléatoires avec la cible d’intérêt
(1), la sélection des séquences qui ont reconnu cette cible
(2,3), l’amplification de ces séquences par RT-PCR (4,5), puis
leur transcription in vitro (6) (schéma de sélection
in vitro). Ces étapes de sélection, amplification et transcription
constituent un cycle de SELEX et doivent être répétées
(environ 8-15 fois), jusqu’à ce que les candidats ARN/ADN présentant
l’affinité la plus forte pour la cible soient isolés ;
on appelle ces candidats des aptamères. Depuis une dizaine d’années,
la méthode SELEX a été utilisée pour générer
des aptamères dirigés contre des molécules-cibles de
structure et de taille extrêmement variables telles que des acides nucléiques,
des petites molécules organiques (ex : l’ATP) et des cibles plus
complexes comme des récepteurs membranaires ou des cellules entières.
Manuellement, un cycle de SELEX prend deux à trois jours, et par conséquent,
une sélection in vitro peut durer environ deux mois. Des techniques
automatisées de sélection in vitro permettent d’optimiser
ce temps et d’accroître la fiabilité et la reproductibilité
du processus ; la première d’entre elles a été
publiée par Cox et al. (1998). Récemment, à l’Institut
Européen de Chimie et Biologie (IECB) localisé à Bordeaux
(France), nous avons développé de nouvelles techniques automatisées
de sélection in vitro afin de sélectionner et d’identifier
des aptamères en effectuant deux cycles de SELEX par jour. Ainsi la
totalité d’une sélection in vitro peut se faire en huit
à dix jours ; Deux sélections contre deux cibles différentes
peuvent être menées en parallèle et nous espérons
pouvoir doubler cette capacité de traitement dans un avenir proche.
A l’I.E.C.B, nous nous intéressons aux ligands oligonucléotidiques
conçus de façon rationnelle (antisens, siARN) ou selon un processus
combinatoire (SELEX). Les propriétés de fixation des oligonucléotides
pour leurs cibles sont évaluées puis leur activité biologique
est déterminée par des méthodes acellulaires et cellulaires.
La sélection manuelle d’aptamères ADN ou ARN dirigés
contre des motifs ARN structurés et les protéines a déjà
été décrite auparavant (Dausse et al. 2005); la méthode
automatisée a été développée en utilisant
une plate-forme automatique de criblage, le Freedom EVO® 150 (Tecan).
Cette plate-forme est équipée d’un bras robotique manipulateur
et d’un bras de pipetage à huit canaux indépendants qui
effectue l’aspiration et la distribution avec un mode de détection
du niveau de liquide. Divers modules externes intégrés à
la plate-forme permettent une automatisation totale du processus, incluant
un module de séparation par billes magnétiques (Te-MagS™),
un module de séparation sous vide (Te-VacS™), un agitateur orbital
(Te-Shake™), un thermocycleur (MJ Research PTC-200), des hôtels
de stockage pour microplaques et accessoires de laboratoire, des racks thermostatés
pour réactifs (-20 et +4 ∞C) et microplaques, et des supports
pour pointes de pipettes à usage unique. Les ligands candidats sont
sélectionnés en fixant la cible biotinylée et sont capturés
par des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine
; les candidats non fixés sont éliminés par lavage et
l’élution des candidats positifs se fait à haute température.
Les produits de PCR et de transcription sont purifiés par filtration
sur le module Te-VacS™ qui comprend deux positions distinctes d’aspiration
pour récupérer (ou non) la phase éluée. Outre
le gain de temps, le SELEX automatisé améliore la fiabilité
et la reproductibilité du processus, fournissant ainsi des données
de grande qualité pour des études approfondies.
Nous utilisons actuellement des méthodes SELEX automatisées
pour identifier des ligands à forte affinité, dirigés
contre des ARN viraux et diverses protéines intéressantes sur
le plan diagnostique. Nous nous concentrons plus particulièrement sur
la recherche d’aptamères capable de se fixer à des régions
de l’ARN viral impliqué dans l’expression des gènes
et par conséquent participant au développement du virus [Toulmé
et al. 2006]. Etre capable de maîtriser l’expression d’un
gène viral sans affecter l’expression du gène de l’hôte
constituerait une solution idéale pour empêcher le virus de se
développer. Ces molécules peuvent être validées
comme ayant un intérêt thérapeutique dans le cas des virus
pathogènes tels que le VIH et le virus de l’hépatite C
(VHC). Par exemple, la région 5’ non traduite des fonctions du
VHC possède un site d’entrée interne du ribosome (IRES)
qui est très préservé et qui est vital dans l’initiation
de la traduction. Certaines parties de cette région, et plus particulièrement
le domaine IIId, sont des cibles médicamenteuses potentielles, donc
trouver des ligands qui fixent les régions sélectionnées
avec une forte affinité représente un premier pas important
dans la conception d’un médicament [Aldaz-Carroll 2002; Tallet-Lopez
et al. 2003].
Références:
Aldaz-Carroll L, Tallet B, Dausse E, Yurchenko L, Toulme JJ. (2002)
Apical loop-internal loop interactions: a new RNA-RNA recognition motif identified
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Bellecave P, Andreola ML, Ventura M, Tarrago-Litvak L, Litvak S, Astier-Gin
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Chaloin L, Lehmann MJ, Sczakiel G, Restle T. (2002) Endogenous expression
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