Septembre 2007 - n°124

Amélioration des analyses par LC/MS de composés basiques à l’aide d’une phase mobile de pH élevé sur une colonne Gemini® C18

Par Phenomenex

Introduction

Il est très intéressant de réaliser des séparations par HPLC en phase inverse à pH élevé, bien au-dessus des pKa de composés basiques. Lorsque le pH de la phase mobile est supérieur de deux unités de pH aux pKa d’analytes basiques, les espèces non chargées sont mieux retenues sur les phases stationnaires de phase inverse. Résultats : temps de rétention accrus pour les analytes basiques polaires sans avoir à utiliser d’agents de pair d’ions, rétention plus reproductible,
formes de pic affinées, sélectivité de colonne alternative, et élution dans une phase mobile dont la teneur organique est plus élevée, ce qui est avantageux pour la détection LC/MS.

« Contrairement aux attentes, les phases mobiles à pH élevé NE SUPPRIMENT PAS l’ionisation des composés basiques dans l’ESI+; des ions positifs sont formés en abondance… »

L’un des éventuels inconvénients du fait de travailler à un pH basique pourrait être une diminution importante de la sensibilité de la détection par spectrométrie de masse, dans des conditions supprimant l’ionisation des analytes en solution. Étant donné que l’état d’ionisation des molécules d’analytes dépend du pH de la phase mobile, il est attendu que l’efficacité d’ionisation de la LC/MS avec electrospray (ESI) en mode cationique (PIM) soit réduite de manière significative dans les phases mobiles à pH élevé. On emploie de façon courante des acides faibles volatils pour améliorer l'ionisation des composés basiques en ESI+. Ainsi, l’analyse LC/MS des composés médicamenteux basiques en phases mobiles à pH élevé (>pKa+2) pourrait être compromise, si les rendements d’ionisation en phase gazeuse en ESI+ étaient étroitement liés à l’équilibre acide-base de la solution. Néanmoins, plusieurs analystes ont réussi à obtenir la détection de composés basiques particuliers en ESI+, avec l’utilisation de tampons de pH élevé dans la phase mobile.
Dans nos travaux précédents, nous avions indiqué avoir réussi la détection de plusieurs classes importantes de médicaments basiques, notamment des antihistaminiques, des béta-bloquants, des opiacés, et des antidépresseurs tricycliques dans des conditions de phase mobile qui empêchent leur ionisation en solution. Nous avons comparé les réponses pour l’ESI+ de plusieurs groupes de médicaments basiques dans une vaste plage de polarités (log P 0,09 ~7,6) et de pKa (8 ~10), dans des phases mobiles à pH acide et basique. Les intensités du signal des analytes observées dans l’acide formique à 0,1 % avec acétonitrile ont été comparées aux intensités observées dans des tampons d’hydrogénocarbonate d’ammonium 10 mM, à différents pH (7,8 à 11) dans l’acétonitrile. Contrairement aux attentes, les phases mobiles à pH basique NE suppriment PAS l’ionisation de composés basiques dans l’ESI+ ; des ions positifs sont formés en abondance, et les réponses des analytes sont souvent meilleures avec un pH basique que dans des phases mobiles acides. Les résultats montrent que l’utilisation de phases mobiles à pH élevé pour l’analyse de composés basiques représente une alternative satisfaisante à la pratique actuelle, qui consiste à utiliser des phases mobiles de pH acide en LC/MS avec ESI+. Ce qui est tout à fait significatif, car on étend ainsi les applications de méthodes génériques d’élution à l’analyse de composés basiques polaires, auparavant difficiles à retenir par chromatographie en phase inverse sans compromettre la détection par spectrométrie de masse.

Nous avons testé l'utilisation de phases mobiles à pH élevé, pour la quantification de composés basiques par LC/MS/MS avec ESI+, en comparant les seuils de détection (LOD), les seuils de quantification (LOQ), les plages de linéarité, la précision et l’exactitude obtenues avec des phases mobiles de pH basique et acide.

Résultats et analyses

Procédé LC/MS et sondes d’essai

Nous avons présenté les intensités du signal pour une grande variété de médicaments basiques en mode SIM avec electrospray, en fonction du pH de la phase mobile. De façon générale, l’optimisation de la source d’ions et le réglage du spectromètre de masse se font dans une phase mobile acidifiée, riche en modificateur organique, qui améliore la formation abondante d’ions positifs (bases protonées). Nous avons donc optimisé tous les réglages du détecteur en conditions acides dans une solution d’acétonitrile et d’acide formique à 0,1 %, 1:1. Afin d’étudier l’effet du pH de la phase mobile sur la réponse par MS des composés basiques, nous avons inclus dans cette étude une diversité de bases polaires et non polaires, couvrant une large plage de pKa. Les mélanges standards ont été préparés à une concentration de 200 ng/ml, dans un solvant faible, afin d’éviter les déformations de pics pour les composés basiques polaires éluant rapidement. Les analyses ont été effectuées sur une colonne Gemini C18 de petit diamètre.

Influence des phases mobiles et de la sélection du tampon de pH.

L’élution en phase inverse des composés basiques, lorsqu’ils ne sont pas chargés, entraîne des temps de rétention significativement plus longs des formes de pic plus fines et souvent une modification de l’ordre d’élution (indiquant une sélectivité de colonne alternative). De tels changements constituent une amélioration significative du pouvoir de résolution de la colonne. Le tampon bicarbonate d’ammonium / ammoniaque (NH4HCO3 / NH4OH) s’étend sur une large gamme de pH de 7,8 à 11, avec un pouvoir tampon élevé. Son caractère thermolabile le rend compatible avec les détecteurs MS. Bien que ce tampon supprime l’ionisation des médicaments basiques en solution à un pH élevé, on observe que les intensités de signal des espèces basiques en ESI+ sont supérieures dans les tampons bicarbonate d’ammonium, que dans l’acide formique à 0,1 %.

Seuil de quantification et linéarité des réponses

Le seuil de quantification (LOQ) est considéré comme étant la quantité minimale d’analyte sur la colonne qui fournit un S/B de 10. La plupart des composés basiques étudiés ont été quantifiés avec succès à la concentration de 1,25 pg, ou mieux, certains à des concentrations aussi faibles que 50 fg. Une comparaison des rapports S/B à des concentrations très faibles (50 pg/ml) révèle que la plupart de ces composés basiques peuvent être détectés avec une meilleure sensibilité dans des phases mobiles à pH basiques (figure 5) que dans des conditions acides. Seuls la carbamazépine (LOQ>1 250 fg) et l’amiloride (LOQ>750 fg) ont été détectés avec un S/B inférieur dans une phase mobile à pH élevé. La linéarité des réponses a été étudiée dans la plage de concentrations de 0,05 à 100 ng/ml pour tous les composés basiques. Les résultats (dont certains sont indiqués sur la figure 6) démontrent une bonne linéarité avec des valeurs R2 supérieures à 0,997.

Précision et exactitude

La précision du procédé a été déterminée par des analyses répétées (n=6) pour quatre concentrations : 0,05 ng/ml, 0,25 ng/ml, 1,00 ng/ml et 100 ng/ml. Le tableau 2 indique un ETR < 15 % pour la concentration 0,05 ng/ml et <12 % pour la concentration 100 ng/ml. L’exactitude du procédé a été évaluée par comparaison de la valeur moyenne des six analyses répétées avec la valeur de concentration attendue pour les différentes concentrations. Les concentrations analysées ont été déterminées par régression linéaire des résultats obtenus, sur des calibrateurs standards. L’exactitude dépassait 80 % pour la plupart des analytes lorsqu’ils ont été quantifiés pour leur concentration LOQ respective et égale à 100 % pour la concentration 100 ng/ml.

Conclusions

• L’utilisation de phases mobiles basiques pour l’analyse en LC/MS/MS avec ESI+ des médicaments basiques a été évaluée, sur une large plage de polarités et de pKa, en comparant les seuils de détection et de quantification, les plages de linéarité et le degré d’exactitude observé dans les phases mobiles acides et basique.
• La réussite de la quantification des composées basiques par LC/MS/MS avec ESI+ dans une phase mobile contenant un tampon de pH élevé a été démontrée.
La plupart des composés basiques étudiés peuvent être détectés avec une meilleure sensibilité dans de la phase mobile de pH basique que dans la phase mobile de pH acide.
• Les résultats démontrent la possibilité d’effectuer l’analyse des composés basiques dans des phases mobiles à pH élevé par LC/MS/MS avec ESI+ avec une meilleure sensibilité, de bonnes linéarité, précision et exactitude, à l’aide de la colonne Gemini® 5 µm C18.

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