Décembre 2007 - n°127
La polyvalence du système Maxwell® 16 pour l’extraction de l’ADN génomique
Par PROMEGA
Resumé
Maxwell®16 est un automate compact utilisant des cartouches de réactifs
prêtes à l’emploi et des programmes pré-enregistrés
pour augmenter la performance et la flexibilité, tout en diminuant
le temps de manipulation nécessaire à l’extraction des
acides nucléiques. Cette association permet des gains de temps, une
augmentation de la productivité et une standardisation des résultats.
Polyvalent, le système Maxwell®16 dispose de kits de purification
pour l’isolement d’ADN génomique analysé ultérieurement
par PCR, à partir d’échantillons d’organismes animaux,
de tissus végétaux, fongiques, bactériens et alimentaires.
Maxwell®16
Le système intégré Maxwell® 16 offre une option automatisée
pour petites et moyennes séries pour l’isolement à partir
d’échantillons végétaux, animaux, fongiques et
bactériens d’ADN génomique analysé ultérieurement
par PCR
Introduction
La purification de l’ADN et son analyse par PCR sont des techniques
critiques utilisées pour déterminer la souche génétique
d’une plante, détecter des mutations ou des modifications génétiques
dans un organisme et identifier des microorganismes présents dans un
échantillon. Ainsi, les techniques de purification de l’ADN réalisées
régulièrement en routine, sont souvent élaborées
sur mesure afin de répondre aux exigences spécifiques du type
d'échantillon analysé.
C’est pourquoi le système Maxwell® 16 a été
développé pour satisfaire aux besoins des utilisateurs de petites
et moyennes séries, leur offrant la possibilité d’une
purification automatisée et standardisée à une échelle
adaptée à leur charge de travail et ne nécessitant ni
investissements lourds, ni formation, ni maintenance (1). Les cartouches pré-remplies
et l’action mécanique du piston du système Maxwell®
16 en font un instrument idéal pour la purification simple et rapide
d’une vaste gamme d’échantillons qui nécessiteraient
normalement des phases laborieuses de retraitement (par ex. digestion par
protéase durant 16 heures ou toute une nuit, broyage à billes
en présence d'azote liquide).
Les kits du système Maxwell® 16 et les protocoles pré-programmés
ont été optimisées pour l'isolement d'ADN génomique
à partir de divers échantillons tels que le sang, différents
types de cellules et tissus. Cet article décrit l’utilisation
de ces cartouches et de ces méthodes pour l'isolement d'ADN génomique
à partir de ces échantillons utilisés dans la recherche
fondamentale et la recherche appliquée.
Organismes animaux
L’ADN génomique est fréquemment isolé à
partir d’insectes et de modèles d’organisme animal, comme
les mouches des fruits et Caenorhabditis elegans. Après purification,
l’ADN est utilisé dans de nombreuses applications en aval telles
que le clonage, l’amplification et l’analyse des mutations.
Généralement, l’isolement de l’ADN commence par
la rupture des parois de l’organisme en broyant les tissus congelés
ou par digestion longue par des protéases. Nous démontrons ici
l’utilité de l’instrument Maxwell® 16 pour l’isolement
de l’ADN directement depuis des organismes sans besoin de prétraitement
:
Des échantillons entiers d’organismes ou de tissus ont été
placés directement dans la cartouche Maxwell®16 Tissue DNA purification
kit. Avec la méthode Maxwell® 16 pour les tissus, la quantité
indiquée d’ADN a été isolée. La qualité
de l’ADN génomique purifié a été analysée
par PCR temps réel avec le système Plexor® qPCR (Réf.
cat. A4011). Des amorces spécifiques aux organismes ont été
conçues et utilisées pour chaque type d’échantillon.
Tous les échantillons d’ADN purifiés testés par
PCR ont été amplifiés avec succès.
Selles
La détection de bactéries dans des échantillons de selles
est essentielle pour l’identification d'agents pathogènes potentiellement
nocifs. Néanmoins, l’amplification de l’ADN isolé
peut s'avérer être un véritable défi, non seulement
parce que l’ADN peut être difficile à extraire, mais également
parce que les inhibiteurs de la PCR sont souvent purifiés en même
temps. L’isolement requiert généralement plusieurs phases
de prétraitement telles que le broyage à bille ou des incubations
laborieuses pour casser les échantillons. Nous avons découvert
que l’action mécanique des pistons de l’instrument Maxwell®
16 était suffisante pour assurer la rupture des échantillons
de selles avec un cisaillement minime de l’ADN.
En traitant des boulettes fécales simples de souris (poids moyen =
38 mg) avec la cartouche Maxwell®16 Tissue DNA purification kit et le
protocole associé, nous avons obtenu une moyenne de 48 µg d’ADN
purifié par échantillon. (Données non présentées).
Souvent, l’ADN isolé à partir d’échantillons
de selles contient des inhibiteurs en quantités significatives, tels
que des dérivés phénoliques et des polysaccharides, qui
peuvent empêcher l’amplification de l’ADN.
Pour détecter la microflore dans des échantillons de selles,
l’ADN a été isolé avec le système Maxwell®
16, puis testé à l’aide d'amorces d’ARN ribosomique
16S eubactérien Sur huit échantillons, un échantillon
a pu être amplifié sans dilution ni autre traitement de l'ADN
purifié. Lorsque l’ADN a été soit dilué
dans l’eau au rapport 1 :100, soit passé sur un filtre à
rotation Zymo-Spin™ IV-HRC rempli de polyvinylpyrrolidone réticulée
(Zymo Research) et centrifugé pendant une minute, nous avons constaté
que les ADN de tous les échantillons traités ont pu être
utilisé directement en PCR.
Végétaux
L’ADN est isolé en routine à partir de végétaux
dans le but de déterminer la souche génétique d’une
plante ou de détecter des modifications génétiques. Nous
avons testé la capacité du système Maxwell® 16 pour
l’extraction de l’ADN à partir d’une vaste gamme
de feuilles et de graines de végétaux. De nombreux échantillons
de végétaux ont donné des quantités significatives
d'ADN amplifiable avec le Maxwell®16 Tissue DNA purification kit sans
besoin de prétraitement.
Néanmoins, certains échantillons de végétaux,
comme des feuilles ou des graines tenaces, peuvent être difficiles à
casser. Ces types d’échantillons ont été soumis
à un prétraitement avec le système CelluACE™ XG
(Réf. cat. FF3800), un mélange de cellulose et d'autres carbohydratases
capables de digérer des tissus végétaux.
Certains tissus végétaux contiennent une part élevée
de dérivés phénoliques, qui peuvent réduire l'efficacité
de l'isolement de l'ADN et inhiber l’analyse ultérieure par PCR.
Pour ces échantillons connus pour renfermer un taux élevé
de dérivés phénoliques, de la polyvinylpyrrolidone (PVPP
; Sigma) a été incluse dans la phase de digestion avec le système
CelluACE™ XG. L’ADN a ensuite été testé par
PCR temps réel avec le système Plexor® qPCR.
Tous les échantillons d’ADN purifiés testés ont
été amplifiés avec succès.
Bactéries et Champignons
L’ADN est isolé à partir d’échantillons cliniques
et d’échantillons de l’environnement pour rechercher la
présence de microbes tels que des bactéries ou des champignons.
Le Tableau 3 présente des exemples de bactéries et de champignons
qui ont été utilisés avec succès avec le kit(a)
de purification de l’ADN cellulaire Maxwell® 16. Pour l’isolement
de l’ADN à partir de bactéries, des cultures de 16 heures
(une nuit) en milieu liquide pouvant atteindre 400 µl ont été
utilisées (jusqu’à 2 x 109 cellules) ; pour les échantillons
de champignons, des colonies simples ont été utilisées.
Afin de maximiser la libération d’ADN, des bactéries à
gram positif ont été prétraitées avec un lysozyme
(traitées dans 400 µl de tampon TE avec 2,5 mg de lysozyme pendant
2 heures à 37 °C) et les champignons ont été prétraités
avec une lyticase (des colonies simples ont été traitées
avec 200 unités de lyticase dans 100 µl de tampon TE pendant
3 heures à 37 °C).
Aliments
L’isolement et la détection d'ADN microbien est une phase de
sécurité essentielle dans l’industrie alimentaire. L’ADN
est isolé en routine à partir d’aliments pour détecter
des organismes génétiquement modifiés (OGM). Le Maxwell®16
Tissue DNA purification kit a été utilisé pour extraire
l’ADN à partir de lait ou de fromage ; l’ADN a ensuite
été soumis à une analyse par PCR. Du lait ou du fromage
(400 µl ou ~50 mg) a été ajouté directement dans
le puits n° 1 de la cartouche de purification de l’ADN de tissus
Maxwell® 16. Le rendement en ADN dans le lait a été influé
par la présence de cellules somatiques dont la quantité variait
d'un échantillon à l'autre. Une gamme de consistances de fromage
a été testée. L’ADN était détectable
dans tous les échantillons de fromage testés.
Afin d’examiner la qualité de l’ADN, tous les échantillons
ont été testés par PCR pour détecter la ß-caséine,
et tous ont été amplifiés avec succès (données
non présentées). L’ADN a été utilisé
en PCR multiplexe pour détecter les gènes microbiens (3). La
plupart des échantillons a donné des résultats positifs
pour S. aureus (amplicon 23S rRNA), mais seulement l’échantillon
9 et le témoin positif ont donné des résultats positifs
pour la Toxine D.
ADN d’échantillons d’aliments peuvent être purifiés
en utilisant le Maxwell®16 Système et testés par PCR pour
détecter la présence d’ADN microbien ou GMOs
Conclusion
Le système Maxwell® 16 offre un isolement rapide et automatisé
de l’ADN génomique pour les petites et moyennes séries
pour une vaste gamme de types d’échantillons. L’action
mécanique du piston est idéale pour la rupture de nombreux types
d’échantillons solides, dont les selles, les tissus végétaux
et les aliments. Pour les échantillons de matériaux présentant
une paroi cellulaire tenace, comme les champignons ou les feuilles de blé,
un prétraitement enzymatique peut s’avérer nécessaire
pour maximiser le rendement. Grâce à la construction simple et
aux compositions chimiques et robustes des cartouches pré-remplies
des kits de purification de l’ADN Maxwell® 16, divers types d’échantillons
solides et liquides peuvent être traités facilement pour libérer
de l’ADN amplifiable.
Références
1. Kephart, D. et al. (2006) Promega Notes 92, 20–3.
2. Brow, M.A. et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34, 3129–37.
3. Cremonesi, P. et al. (2005) Mol. Cell. Probes 19, 299–305.
Protocoles
Maxwell® 16 DNA Purification Kits Technical Manual, #TM284, Promega
Corporation
www.promega.com/tbs/tm284/tm284.html