Novembre 1998 - n°32

Test 3D : SFRI innove dans le domaine de la recherche en toxicologie génétique

SFRI, située près de Bordeaux, est une société spécialisée dans le développement, la production et la commercialisation de réactifs et d'instruments pour le diagnostic médical biologique. Récemment, SFRI s'est diversifiée en s'intéressant aux techniques et applications de la biologie moléculaire. Grâce au dynamisme et à l'esprit d'innovation de son équipe de chercheurs, une idée nouvelle voit le jour : développer une méthode rapide, simple, fiable, reproductible et ...économique pour la quantification in vitro des lésions provoquées sur l'ADN par des substances présentant un risque de toxicité génétique. Le Test 3D, Damaged DNA Detection, est né.

Ce test a été développé par SFRI en collaboration avec l'équipe Toxico-Résistance du Professeur Bernard SALLES1 au CNRS de Toulouse.

La Toxicologie Génétique est l'étude et la recherche des agents capables d'altérer le matériel génétique des êtres vivants, mais aussi la vérification des capacités génoprotectrices des produits issus de la pharmacie, de la cosmétique, de l'agro-alimentaire...

Si l'enchaînement génotoxicité / lésion / mutation / cancérisation est à chaque fois conditionnel, la phase initiale d'interaction entre l'agent génotoxique et l'ADN est dans la grande majorité des cas l'étape déclenchante du processus aboutissant au cancer. Elle mérite donc d'être testée.

Une méthode simple pour des applications multiples

Le Test 3D utilise les mécanismes de réparation physiologiques présents dans chaque cellule. Sa simplicité réside dans le fait que :
- il se déroule entièrement sur une microplaque 96 puits,
- il permet l'analyse simultanée de nombreux échantillons,
- le résultat est obtenu en seulement 5 heures.

Selon l'utilisation prévue du produit testé, différentes réponses seront apportées par le test. Il permet par exemple :
- la détection et la quantification des agents réagissant avec l'ADN pour former des adduits, spontanément ou après activation métabolique, ou suite à une photoactivation,
- la détection et la quantification des agents interagissant avec la réparation de l'ADN2 (effets modulateurs inhibiteurs ou activateurs de la réparation),
- la détection et la quantification des agents antioxydants ou anti-radicalaires (mesure de la génoprotection),
- la mesure des effets photogénoprotecteurs des écrans et filtres solaires vis à vis des UV B et UV A "like".

Ce test est donc une méthode alternative originale non seulement pour le criblage de molécules génotoxiques mais aussi pour la recherche de nouveaux antioxydants.

Un complexe protéique de réparation efficace

La détection de lésions sur l'ADN met en oeuvre un complexe protéique cellulaire de réparation de l'ADN, issu d'extraits humains. La présence dans les extraits d'un nucléotide marqué et l'addition d'un substrat luminescent permettent la mesure du signal de réparation en luminométrie avec une grande sensibilité.

Les complexes protéiques spécifiques de réparation utilisés sont efficaces dans les deux grands mécanismes de réparation de l'ADN : la réparation par excision de nucléotides (NER), et la réparation par excision de bases (BER). Les lésions de type mismatch sont elles aussi réparées. Tous les types de lésions sont donc potentiellement reconnus.

Le Test 3D s'adapte !

Deux types d'ADN peuvent être utilisés avec le Test 3D : ADN plasmidique (ADN circulaire d'origine bactérienne) ou ADN génomique isolé à partir d'une culture cellulaire, d'un tissu ou d'un micro-organisme.

· Test 3D et ADN plasmidique
L'ADN cible est adsorbé sur des puits sensibilisés (étape 1), puis incubé avec le produit à tester (étape 2). Les lésions induites sont reconnues puis réparées par les complexes protéiques spécifiques présents dans les extraits cellulaires purifiés d'origine humaine. La réparation des lésions implique une phase d'excision de la zone lésée puis une re-synthèse du fragment d'ADN excisé. Au cours de l'étape de synthèse réparatrice, des nucléotides marqués à la biotine sont incorporés dans l'ADN (étape 3). Ces nucléotides biotinylés sont ensuite reconnus par une molécule d'avidine couplée à la peroxydase (étape 4). Un substrat chimiluminescent de la peroxydase est ensuite ajouté et le signal émis est mesuré par un luminomètre (étape 5). L'intensité du signal est proportionnelle au nombre de lésions réparées.

· Test 3D et ADN génomique
Pour analyser l'ADN génomique avec le Test 3D, il est nécessaire de réaliser une étape préalable d'incubation des cellules avec le produit à tester. Les cellules sont ensuite lysées et leur ADN est extrait. Solyscel, complexe de lyse cellulaire élaboré par SFRI, agit en une seule étape et permet d'isoler l'ADN génomique, exempt de protéines et d'ARN. L'ADN est alors adsorbé sur les puits et le Test 3D peut alors être réalisé comme dans le cas d'un ADN plasmidique.

Le résultat d'une expérience se présente sous la forme :
- pour la génotoxicité, d'un rapport de réparation (signal de l'échantillon sur le signal du contrôle). Le seuil de sensibilité du test est défini comme un rapport de réparation égal à 2.
- pour la génoprotection, d'une concentration de l'échantillon étudié correspondant à 50% d'inhibition de la formation de lésions sur l'ADN. On évalue ainsi l'activité antioxydante ou anti-radicalaire de l'échantillon.

Une détection précoce de la toxicité génétique

La plupart des tests de génotoxicité reposent sur la recherche de mutations ou de cancérisation, conséquences tardives de l'action d'agents génotoxiques. Le test développé par SFRI s'intéresse à la détection in vitro d'agents génotoxiques lors de l'étape précoce du processus d'induction de lésions sur l'ADN.

Le Test 3D permet d'analyser des produits très différents : extraits végétaux et marins, polyphénols et flavonoïdes, huiles essentielles et matières premières aromatiques, colorants, conservateurs, antioxydants, pesticides et polluants, produits pharmaceutiques, produits de beauté, additifs alimentaires...

Ce test trouve donc des applications dans des domaines aussi divers que les industries pharmaceutique, cosmétique et agro-alimentaire, l'environnement ou la recherche scientifique... autant d'applications qui laissent présager un avenir prometteur pour le Test 3D.

Cécile Mathé