Décembre 1997 - n°23
Située au cœur du CHU Rangueil à Toulouse, l'unité INSERM466 fait partie de l'Institut Fédératif de Recherche Louis Bugnard. Dirigée par le Professeur Robert SALVAYRE depuis sa création en 1997, l'Unité 466 compte 33personnes, dont 4chercheurs, 9enseignants-chercheurs, 8ITA et 12étudiants ou post-doc. L'objectif général du programme de l'unité vise à élucider les mécanismes cellulaires de la pathogenèse des maladies métaboliques associées à une surcharge lipidique, lipidoses (héréditaires ou acquises) et athérosclérose. L'une des questions centrales du projet est de comprendre les relations entre accumulation de lipides et dysfonctions cellulaires (activation, prolifération, nécrose ou apoptose), c'est-à-dire les signalisations intracellulaires pathogènes.
Les travaux de recherche sont réparties entre 3 équipes:
Equipe 1 : Métabolisme lipidique; signalisation
et lipidoses
Equipe 2 : Lipoprotéines oxydées et athérosclérose
Equipe 3 : Lymphocytes et athéro-sclérose
Dirigée par Messieurs T.LEVADE et R.SALVAYRE, cette équipe se consacre plus particulièrement à l'étude du métabolisme lipidique cellulaire (compartimentation et voies intracellulaires du métabolisme des sphingolipides et des lipides neutres) et des voies de signalisation par les sphingolipides (sphingomyéline/céramide). Elle a élargi ses travaux à l'étude de la physiopathologie des lipidoses héréditaires et du cancer ainsi qu'au diagnostic pré- et post-natal des lipidoses héréditaires.
Les travaux actuels se situent dans le domaine de la signalisation par les lipides et dans celui des maladies du métabolisme lipidique. La recherche est essentiellement de nature expérimentale, avec pour but général l'étude des mécanismes de la surcharge lipidique au cours des lipidoses héréditaires. Le programme de recherche comporte trois axes:
- la biologie et la pathologie cellulaire du métabolisme des lipides (sphingolipides et lipides neutres): études du trafic lipidique intracellulaire, des systèmes enzymatiques de dégradation des lipides, de la compartimentation métabolique et du rôle des enzymes du métabolisme des sphingolipides dans la transduction du signal,
- la biologie moléculaire des enzymes du métabolisme lipidique: recherche des mutations dans certaines lipidoses, création de nouveaux modèles expérimentaux des lipidoses héréditaires,
- la signalisation intracellulaire lipidique (voies de transduction par les sphingolipides): mécanismes, facteurs initiateurs, effets biologiques.
Pour mener à bien les différents travaux de recherche, les membres de l'équipe maîtrisent différents procédés techniques, parmi lesquels on peut citer:
- la culture cellulaire et la transformation cellulaire
- la biochimie des lipides: chromatographie sur plaque, chromatographie en phase gazeuse,
- les enzymes lysosomales: dosages in vitro et sur cellules intactes,
- les lipides fluorescents,
- le métabolisme des lipides sur cellule vivante et le diagnostic des lipidoses,
- la biochimie des lipoprotéines: isolement, marquage,
- les études de mutations de protéines enzymatiques (séquençage, expression),
- l'étude de facteurs de transcription (gel shift).
Sous la direction de Mmes NEGRE-SALVAYRE et PIERAGGI, cette équipe s'intéresse aux mécanismes d'oxydation des LDL -lipoprotéines de basse densité- par les cellules, aux effets biologiques des LDL oxydées et des produits d'oxydation lipidiques sur les cellules vasculaires, aux effets prolifératifs et toxiques des LDL oxydées ainsi qu'à la mort par apoptose ou par nécrose induite par les LDL oxydées. Le rôle du calcium dans la mort cellulaire ainsi que les mécanismes d'action des agents protecteurs sont également explorés. L'équipe étudie aussi les types lésionnels, observés sur des pièces d'athérectomie obtenues par athérectomie directionnelle, chez des patients porteurs d'infarctus du myocarde, d'angor instable et d'angor stable.
Les recherches en cours concernent l'étude de l'implication d'UCP2, une protéine mitochondriale découplante, dans les mécanismes d'oxydation des LDL par les cellules, de même que le rôle de la sécrétion de molécules anti-oxydantes et l'implication de NADH/NADPH oxydase. Sont également étudiées les voies de transduction stimulées par les LDL oxydées et les produits d'oxydation (4-hydroxynonenal) sur la prolifération et la mort cellulaire. L'équipe évalue le rôle des anti-oxydants endogènes et des systèmes de protections intracellulaires (glutathion, Bcl2, protéasome), ainsi que les mécanismes de protection des HDL -lipoprotéines de haute densité- et des anti-oxydants. Le travail se poursuit actuellement avec la mise en évidence de cytokines en immunohistochimie et RTPCR sur les pièces d'athérectomie.
Les compétences maîtrisées par les membres de l'équipe sont notamment:
- la culture cellulaire et la prolifération,
- la biochimie des lipoprotéines (isolement, marquage, électrophorèse),
- le dosage des produits d'oxydation lipidique (TBARS, hydroperoxydes, 4-hydroxynonenal en HPLC), et de la production de radicaux libres oxygénés (extracellulaires et intracellulaires),
- le Western blot, l'immunoprécipitation de protéines, la mesure de seconds messagers,
- les techniques d'évaluation de la prolifération et de la mort cellulaire (TUNEL, électrophorèse d'ADN),
- les techniques d'immunocytochimie et de microscopie électronique et optique.
Dirigée par Messieurs BENOIST et THOMSEN, cette équipe s'intéresse aux modèles cellulaires de réponse immunitaire in vitro, utilisant des lymphocytes effecteurs clonés et/ou immortalisés et des cellules cibles modifiées par transfection (de gènes mutés du CMH) ou électroinsertion (glycoprotéines de surface). Les travaux portent aussi sur les mécanismes d'activation (signalisation intracellulaire) des cellules immunitaires au cours de l'athérogenèse, sur l'effet des LDL oxydées sur les lymphocytes, sur l'interaction avec les cellules cibles impliquées dans les lésions ainsi que sur l'effet allogénique. Des études immunogénétiques des marqueurs du CMH sont également conduites.
Les résultats récents de l'équipe ont montré que les LDL oxydées pouvaient avoir des effets immunosuppresseurs; tels que l'inhibition de la prolifération des lymphocytes TCD4 et de la synthèse de lymphokynes. L'impact des LDL oxydées est étudié sur les voies de transductions impliquées dans l'activation des gènes de cytokines. Les LDL oxydées à forte concentration induisent la mort cellulaire et l'équipe travaille donc à élucider les mécanismes en cause. La réaction allogénique peut être impliquée dans l'athérosclérose accélérée au cours du rejet chronique. Les mécanismes d'action des cytokines produites par les lymphocytes sont étudiés au niveau cellulaire et transductionnel sur les cellules de la paroi vasculaire (cellules musculaires lisses).
L'équipe réunit elle aussi de nombreuses compétences techniques, telles que:
- la biologie et la culture cellulaire,
- les tests de prolifération et de cytotoxicité (isotopes3H et51Cr),
- la cytométrie en flux,
- l'isolement de sous-populations lymphoïdes,
- le clonage,
- l'immortalisation lymphocytaireT etB.
Les techniques de biologie moléculaire (transfections aléatoires ou ciblées, mutagénèse dirigée, southern et northern blot, construction de vecteurs) ainsi que l'électrophorèse, la microscopie ou les techniques ELISA sont largement utilisées.
L'unité INSERM466, toutes équipes confondues, collabore avec de nombreuses équipes, tant en France qu'à l'Etranger (en particulier dans le cadre d'un programme européen Biomed-2). Enfin, l'Unité collabore avec différents services cliniques des hôpitaux du grand Sud-Ouest pour le diagnostic pré et post-natal de maladies métaboliques héréditaires. Par ailleurs, la richesse de ses publications ainsi que le nombre de thèses soutenues au cours des 5dernières annèes attestent du dynamisme de ses membres. L'Unité participe également à des actions de formation en accueillant de nombreux étudiants en thèse et en DEA.
C.D.