Parmi ses équipements- clés : trois lecteurs de microplaques FLUOstar® Omega BMG LABTECH !
Des laboratoires Rocky Mountain du Montana (États-Unis), en passant par le National CJD Research & Surveillance Unit de l’Université d’Edinburgh (Royaume-Uni), jusqu’à l’équipe « maladies à prions » de l’unité U1127 au sein de l’Institut du Cerveau, Hôpital Pitié Salpétrière (Paris)… la majorité des laboratoires dans le monde qui étudient les maladies à prions utilisent les lecteurs de microplaques BMG LABTECH et en particulier les lecteurs CLARIOstar® et FLUOstar® Omega. Les capacités spécifiques de ces derniers en termes d’agitation, d’incubation et de lecture de fluorescence ont d’ailleurs été mises à contribution pour la mise au point d’une méthode in vitro de détection rapide des prions, sensible, et à haut débit, baptisée Real-Time Quaking- Induced Conversion Assay (RT-QuIC).
M. Etienne LEVAVASSEUR, ingénieur de recherche au sein de l’équipe Maladies à prions, unité Inserm U1127 – Institut du Cerveau, nous invite à découvrir ses travaux. Equipements clés parmi les appareils de l’équipe : trois lecteurs de microplaques BMG LABTECH, FLUOstar® Omega…
Une entité de l’équipe « Maladie d’Alzheimer, maladies à prions »
Etienne LEVAVASSEUR exerce son activité d’ingénieur de recherche au sein de l’équipe « Maladie d’Alzheimer, maladies à prions » de l’Institut du Cerveau (Unité Inserm U1127 / Sorbonne Université / UMR CNRS 7225), dirigée par Marie-Claude POTIER et Stéphane HAIK, sur le campus Pitié Salpêtrière – APHP, Paris 13. Cette équipe s’intéresse, entre autres, aux mécanismes moléculaires impliqués dans l’initiation et la progression de la maladie d’Alzheimer et des maladies à prions.
Les prions – dont le nom est une contraction du terme « proteinaceous infectious particle » - sont des protéines avec une conformation anormale, et à ce jour les seuls agents infectieux dénués de matériel génétique (ADN ou ARN), contrairement aux agents transmissibles conventionnels que sont les virus, les bactéries et les parasites. De nombreux rôles ont été attribués à la protéine prion normale (PrP), exprimée surtout par les neurones ; la conformation anormale de la PrP est caractérisée par une résistance à la dégradation par la protéinase K (enzyme qui dégrade les protéines), on parle alors de PrPsc (pour « scrapie », la tremblante du mouton). L’accumulation de PrPsc dans le cerveau est associée à un dysfonctionnement cellulaire et, à terme, à une mort neuronale. La propagation des prions repose ainsi sur leur capacité à interagir avec la forme normale de la protéine prion, d’en changer la conformation et de la convertir en forme pathologique.
Certains des mécanismes décrits dans les maladies à prions, dont la forme la plus connue est la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ), ont été impliqués dans d’autres protéinopathies du système nerveux central telles que les maladies de Parkinson et d’Alzheimer, qui ont pour point commun une conformation anormale d’une protéine de l’hôte qui a la capacité de transmettre sa conformation pathologique.
L’équipe de Stéphane HAÏK à l’Institut du Cerveau travaille tout particulièrement sur ce phénomène de conversion de la protéine normale PrP vers une protéine mal conformée PrPsc qui, en s’accumulant, entraine la dégénérescence des neurones.
Comment détecter la protéine prion ? De la PMCA à la RT-QuIC…
La détection des prions in vitro a tout d’abord pu être réalisée au début des années 2000 grâce à la mise au point d’un nouveau modèle d’amplification acellulaire, la PMCA (Protein Misfolding Cyclic Amplification). La technique consiste à mettre en présence une très faible quantité de protéine prion anormale (par ex, des dilutions d’un homogénat de cerveau infecté) avec un excès de protéine cellulaire de forme normale (PrPC), fourni par un homogénat de cerveau sain, puis d’appliquer une alternance de cycles de sonications et d’incubation. En répétant ces cycles, le nombre de polymères de PrPsc générés in vitro augmente de façon exponentielle sur le même principe que la PCR, avant analyse par Western Blot.
En 2007, est développée aux Etats-Unis une autre technique d’amplification in vitro : la RT-QuIC, pour « Real-Time Quaking- Induced Conversion ». Le substrat utilisé n’est alors plus la PrPC d’un homogénat de cerveau comme pour la PMCA, mais de la PrP recombinante, mise en contact avec l’échantillon contenant la PrP anormale d’intérêt et à laquelle est ajouté un colorant fluorescent : la thioflavine T. Le principe repose sur la capacité de la PrP anormale à s’agréger sous forme de dépôts amyloïdes [des structures en feuillets-β], sur lesquels se fixe spécifiquement la thioflavine. La fluorescence émise par cette dernière permet ensuite une quantification automatisée de la protéine prion. L’étape de sonication, qui pose des problèmes de reproductibilité d’une expérience à l’autre, est remplacée par des cycles d’agitation. L’étape finale d’analyse par Western blot n’est plus nécessaire.
Etienne LEVAVASSEUR, plus de 13 années de recherches centrées sur les prions
Etienne LEVAVASSEUR a rejoint l’Institut du Cerveau en 2007, et développe au sein de l’équipe de Stéphane Haïk ces techniques de détection de prions, tout en poursuivant une activité de recherche fondamentale. Ses collègues, Audrey CULEUX et Patricia LAMY, détectent la PrP anormale à l’aide de la RT-QuIC dans le LCR de patient suspects de MCJ. Une quinzaine de personnes au total collaborent ainsi aujourd’hui sur la thématique Prions au sein de l’équipe « Maladie d’Alzheimer, maladies à prions », sous la co-direction de Stéphane HAÏK.
« Quand j’ai rejoint l’équipe de Stéphane Haïk, une des questions était de détecter des prions dans le sang, pour sécuriser les pools de plasma pour fractionnement du LFB. Notre équipe, qui coordonne le Réseau national de surveillance de la MCJ et le Centre national de référence des prions (Inserm, Institut du Cerveau), a collaboré sur cette thématique avec une équipe de recherche de l’Etablissement français du sang (EFS), l’INRA et le National CJD Research and Surveillance Unit du Royaume-Uni. »
Formé à la QuIC en 2011 au sein du National CJD Research & Surveillance Unit de l’Université d’Edinburgh, puis des laboratoires Rocky Mountain aux Etats-Unis, Etienne LEVAVASSEUR contacte BMG LABTECH dès son retour pour faire l’acquisition d’un lecteur de microplaques et implanter le protocole QuIC au sein de l’Institut du Cerveau. « Sur le site de la Salpêtrière, nous avons le grand avantage d’avoir accès facilement à des tissus humains », précise M. LEVAVASSEUR. « Avec le développement des applications, nous avons investi dans un second lecteur de microplaques BMG LABTECH, puis un troisième : tous trois sont des lecteurs FLUOstar® Omega ».
Trois FLUOstar® Omega BMG LABTECH en environnement L3
« Nos laboratoires sont répartis sur plusieurs sites de la Pitié Salpétrière ; deux de nos trois FLUOstar® Omega sont installés dans le L3 au sein de l’animalerie de la faculté de médecine, et le troisième dans le L3 situé au laboratoire de neuropathologie, sur le campus de l’hôpital », ajoute M. LEVAVASSEUR.
« Depuis une dizaine d’années, nous utilisons les lecteurs FLUOstar® Omega, dont les capacités d’agitation, d’incubation et de lecture de fluorescence permettent la détection des prions dans le cadre du protocole RT-QuiC. La méthode consiste à suivre en temps réel l’évolution du signal de fluorescence de la thioflavine T en relation avec l’amplification de prions. Nous travaillons principalement avec des homogénats de tissus infectés, et du LCR de patients dans le cadre de nos activités de centre national de référence », complète Etienne LEVAVASSEUR. « Le mélange réactionnel déposé dans les puits de plaques 96 contient de l’eau, du PBS, de l’EDTA, du NaCl, de la thioflavine T, la protéine PrP recombinante comme substrat, et le « seed », la protéine infectieuse prion, présente dans le tissu d’intérêt. En 2017, après nous être fournis pendant 5 années auprès d’autres laboratoires, nous avons décidé de produire en interne nos protéines recombinantes. Nous avons mis en place une plateforme de production de protéines recombinantes en L3 avec toutes les contraintes que cela représente, mais nous sommes aujourd’hui autonomes ; la production d’un lot nous permet d’obtenir en 2 semaines environ 50 mg de protéine recombinante ; il en faut 1 mg par plaque… »
Le « seed » transmet sa conformation pathologique au substrat et la thioflavine se fixe par affinité sur les structures riches en feuillets-β des dépôts amyloïdes résultant de l’agrégation de protéines prions anormales. « Nous voyons alors apparaître une fluorescence dont l’intensité et le moment d’apparition dépendent directement de la concentration de prions dans l’échantillon initial », poursuit le chercheur.
La méthode repose sur la répétition de cycles d’agitation et de repos sous incubation. Selon les applications, les cycles peuvent varier, mais initialement, la durée de chaque phase d’agitation et de repos est de 60 secondes ; l’agitation double orbitale est fixée à 700 rpm et la température d’incubation à 42°C. Ce cycle est répété sept fois, soit pendant quasi 15 minutes, avant lecture et acquisition de données. Le chariot de plaque se déplace alors de façon automatique en continu, toutes les 15 minutes ; un nouveau cycle débute et ceci jusqu’à l’obtention de la courbe de mesures finale, au bout de trois à quatre jours.
Des atouts clés en termes notamment de robustesse et de précision…
« La robustesse et la précision du FLUOstar® Omega en font un des seuls lecteurs de microplaques suffisamment précis et robustes pour résister à ces agitations prolongées et à grande vitesse requises pour ce protocole », souligne M. NESLON, gérant de la société BMG LABTECH. « Ce protocole aurait également pu être réalisé avec le lecteur CLARIOstar® comme c’est le cas aux Etats-Unis au sein du Rocky Mountain Laboratories où 15 appareils travaillent en parallèle dans une même salle du laboratoire ».
| Fondée en 1989, la société BMG LABTECH s’impose de fait depuis plus de trente ans parmi les spécialistes du développement et de la fabrication de systèmes de détection sur microplaques, avec des lecteurs et équipements de haute qualité, de tous formats - de 6 à 3456 puits - en fluorescence (intensité, temps résolu, polarisation de fluorescence, FRET, HTRF [marque déposée de la société Cisbio International]), en absorbance (y compris UV), en luminescence (BRET, Flash et Glow) et en néphélométrie… La fiabilité, la sensibilité et la rapidité des produits BMG LABTECH sont unanimement reconnues. |
« Depuis neuf ans que nous avons fait l’acquisition du premier lecteur FLUOstar® Omega, nous n’avons jamais eu de souci de fonctionnement ! L’appareil est robuste et ne nécessite pas de maintenance particulière », tient à préciser Etienne LEVAVASSEUR. « Un autre atout important du système FLUOstar® Omega pour nos recherches est son format microplaque », ajoute-t-il. « Nous pouvons lancer une expérience avec une vingtaine d’échantillons que nous testons en tri- ou quadriplicats. Le format plaque 96 puits – pour un volume réactionnel de 100 µl - répond parfaitement à nos besoins ».
Soulignons également que les trois lecteurs de microplaques ont été installés et programmés par BMG LABTECH à partir du même protocole écrit initialement dans les Rocky Mountain Laboratories . « Dans la mesure où le protocole de RT-QuIC générique repose sur une alternance d’agitation et d’incubation, les seuls paramètres à modifier selon les besoins sont la température d’incubation, la vitesse d’agitation, et les temps d’agitation/incubation ». « Ce n’est pas une demande fréquente de nos utilisateurs – la très grande majorité au contraire désire disposer d’une grande autonomie grâce à des appareils très largement ouverts – mais nos systèmes s’adaptent aux exigences et contraintes de chacun », complète le dirigeant de BMG LABTECH.
Et comment suivre le bon déroulement du protocole et l’acquisition des données sur trois à quatre jours ? « J’ai configuré l’accès à chaque machine qui pilote un FLUOstar® Omega via le bureau à distance de Windows 10 depuis les ordinateurs au laboratoire, et via une licence Teamviewer pour les accès de chez soi », explique M. LEVAVASSEUR « Nous pouvons ainsi récupérer et analyser les données à distance une fois l’expérience terminée, ce qui nous fait gagner un temps précieux en évitant notamment des déplacements à l’autre bout de l’hôpital, des entrées répétées en zones L3 dont l’accès est contraignant, sans parler aujourd’hui du confinement et du télétravail…Enfin, de manière à sécuriser l’alimentation électrique du système, nous nous sommes équipés d’onduleurs dès 2011 ; la moindre coupure de courant est fatale, pour une expérience qui dure 3-4 jours… »
De la recherche au diagnostic… des prions au Sars-Cov-2
Depuis cinq ans, les trois lecteurs de microplaques BMG LABTECH FLUOstar® Omega sont également utilisés à des fins de mise au point de test diagnostique par l’équipe « Maladies à prions » de l’Institut du Cerveau, pour la détection de la maladie de Creutzfeldt-Jakob dans le liquide céphalo-rachidien. « En tant que Centre National de Référence (CNR) des prions, nous recevons des échantillons de patients de toute la France et notre laboratoire est le seul dans l’Hexagone à avoir validé cette technique sur un très grand nombre d’échantillons », ajoute M. LEVAVASSEUR.
Entre autres instruments dont est dotée l’équipe de Stéphane Haïk : un système AKTA pour FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) pour la purification de protéines recombinantes, un spectrophotomètre, du matériel de Western blot, des PSM, des sonicateurs, centrifugeuses et… dernier investissement en date : une solution d’acquisition numérique Vilber Lourmat pour le Western blot. « Nous allons nous équiper prochainement d’un nouveau spectrophotomètre pour le dosage des protéines recombinantes hors du L3 », précise le chercheur.
Parallèlement à ses thématiques de recherche historiques sur les maladies à prions, l’équipe diversifie ses activités et s’implique dans le cadre de la pandémie de Sars Cov-2 pour détecter le virus dans différents tissus…
Pour en savoir plus :
www.creutzfeldt-jakob.aphp.fr/index.htm
Amplification techniques and diagnosis of prion diseases ; Brandel et al, Revue Neurologique, 2019
Etienne LEVAVASSEUR
Etienne.levavasseur@icm-institute.org
Pascal NESLON
Pascal.neslon@bmglabtech.com
S. DENIS
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