Découverte d'anticorps monoclonaux spécifiques d'un antigène grâce au criblage de cellules B uniques

Par Sino Biological - www.sinobiological.com

Introduction
Depuis l'approbation de l'Orthoclone OKT3 en 1986, plus de 100 anticorps monoclonaux (AcM) ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) pour traiter une variété de maladies allant des troubles auto-immunes aux maladies infectieuses et au cancer [1-2]. Dans le contexte de la pandémie de COVID-19, il est crucial que ces produits biologiques soient développés rapidement et efficacement. Parmi les différentes approches de découverte d'anticorps, la technologie des hybridomes et le criblage de cellules B uniques. Ce dernier est une stratégie puissante et efficace pour générer des AcM spécifiques d'antigènes, basée sur l'amplification directe des gènes codant pour les régions VH et VL à partir de cellules B uniques [3-4]. Le criblage de cellules B uniques présente plusieurs avantages, notamment le maintien de l'appariement VH/VL naïf, la nécessité d'un nombre relativement faible de cellules et la possibilité de découvrir des anticorps contre des cibles difficiles.

Technologies de criblage de cellules B uniques
Les technologies de criblage de cellules B uniques sont apparues et ont évolué rapidement au cours de la dernière décennie. Le processus comprend l'isolement, la culture, le séquençage et le clonage de cellules B uniques et le criblage d'anticorps de cellules B uniques sélectionnées. Au stade initial du dépistage des cellules B, plusieurs plates-formes sont utilisées, notamment le Berkely Lights Beacon®, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et les technologies à base de billes ou de FRET.
Chez Sino Biological, notre équipe a établi une plate-forme Beacon et une plate-forme de cytométrie en flux matures pour le criblage à haut débit.

Criblage des cellules B uniques à l'aide de FACS (tri cellulaire activé par fluorescence)
Le FACS est généralement utilisé par les chercheurs pour isoler des cellules uniques grâce à son haut débit et sa sensibilité. Le principe que sous-tend le tri des cellules B est la distinction claire entre les cellules B spécifiques d'un antigène et les autres sous-ensembles de cellules B basées sur les marqueurs de surface cellulaire spécifiques [5]. Les cellules B sont criblées et triées par cytométrie de flux, après avoir été prélevées sur des animaux ou des patients immunisés. Si le panel de cytométrie en flux est disponible, les cellules peuvent être distinguées et triées à différents stades de développement et de différenciation sur la base de l'expression spécifique des marqueurs de surface cellulaire. Les chercheurs s'intéressent aux cellules B à mémoire à mutation de classe et aux cellules sécrétant des anticorps (ASC). En utilisant des anticorps à marquage fluorescent ciblant CD19, IgM, IgD, IgG1 et des antigènes, il est possible de sélectionner les cellules B qui présentent une affinité de liaison élevée. Les cellules sélectionnées sont soit lysées directement après le tri en vue de leur séquençage, soit mises en culture et font l'objet d'un criblage supplémentaire à l'aide d'un ELISA avec le surnageant de culture avant la lyse des cellules.

Criblage des cellules B uniques à l'aide de Berkely Lights Beacon®
L'utilisation de la technologie Beacon consiste à placer des milliers de cellules B à mémoire activées et d'ASC dans des chambres NanoPen®. Un surnageant contenant les anticorps sécrétés réagit avec les billes recouvertes d'antigènes entourées d'anticorps secondaires conjugués par fluorescence. La fluorescence indique alors les anticorps spécifiques de l'antigène et les clones souhaités. Le criblage de plusieurs milliers de clones prend de quelques minutes à quelques heures. Les clones sélectionnés sont exportés et récupérés pour la lyse à l'aide d'un système à base de lumière structurée appelé OptoSelect™ OEP (positionnement opto-électrique).

Avantages et inconvénients
Par rapport aux méthodes d'hybridomes traditionnelles, les plate-formes de criblage de cellules B uniques offrent des modes de recherche et développement (R&D) et de production différents. Les méthodes traditionnelles tout comme les méthodes de cellules B uniques permettent d'obtenir un appariement VH/VL naïf, mais les plates-formes de cellules B uniques sont capables de cribler plusieurs milliers de clones individuels en peu de temps, ce qui permet d'isoler des fixateurs rares. Les coûts de R&D sont plus élevés avec la technologie de criblage de cellules B uniques en raison des prérequis. (Tableau 1)

Étude de cas : Découverte d'inhibiteurs de points de contrôle pour TIM-3

En utilisant des plates-formes de criblage de cellules B uniques, Sino Biological a développé des anticorps monoclonaux anti-TIM-3 avec une haute affinité et une activité neutralisante. Après le triage et la prolifération des cellules, 200 anticorps d'antigènes spécifiques ont été identifiés à partir de 1 100 surnageants de cellules B uniques. La cinétique et l'affinité de 63 anticorps monoclonaux anti-TIM-3 purifiés et positifs à l'ELISA ont été évaluées à l'aide de la technologie d'interférométrie en bicouche (BLI). Parmi les anticorps évalués positifs à l'ELISA, cinq ont montré une haute affinité entre 1010 et 1012 M (figure 2). Il a été montré que cinq AcM anti-TIM-3 bloquaient l'interaction entre TIM-3 et PtdSer de manière efficace et dose-dépendante, avec une CI50 de 0,070 ± 0,010 μg/mL qui était proche de celle du contrôle positif (figure 3).

Références
[1] DOI : 10.1016/j.intimp.2021.108112
[2] DOI : 10.1186/s12929-019-0592-z
[3] DOI : 10.1007/978-1-4939-8958-4_5
[4] DOI : 10.1016/j.nbt.2011.03.014
[5] DOI : 10.1371/journal.pone.0152282


Partager :