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De nouveaux outils à l'appui de la fabrication de VAA

01/12/2021

Avec les évolutions rapides dans le domaine de la thérapie génique, l'utilisation de vecteurs viraux, en particulier de VAA, pour traiter diverses maladies monogéniques et héréditaires chez les patients humains, prend de l'ampleur. Il existe toutefois encore des options pour optimiser la production de tels vecteurs dans les cellules de mammifères.

Système à 2 plasmides
Pour la production de vecteurs VAA, PlasmidFactory propose dans le monde entier, et de façon exclusive, un système à 2 plasmides pour la transfection de lignées cellulaires productrices (par exemple HEK293), remplaçant l'ancien système à 3 plasmides. Une construction porte les fonctions d'encapsidation du VAA, de type rép et cap, et les fonctions auxiliaires adénovirales. Sur la seconde construction, le gène eucaryote d'intérêt est présent, flanqué de séquences de répétition terminale inversée (RTI), entraînant un avantage significatif en termes de coût pour l'utilisateur.

L'intégrité de la séquence de ces RTI est cruciale pour une amplification réussie de titres viraux élevés. Cependant, les RTI sont très instables lors de la réplication plasmidique. En fonction des conditions de culture appliquées, il en résulte une fraction de plasmides, contenant des RTI raccourcis, non fonctionnels, inutiles dans la production de VAA.

Sauvetage RTI
Le contrôle de qualité standard pour les séquences RTI consiste en une digestion de restriction avec Smal.
Cependant, celle-ci n'est pas encore précise à 100% dans la détection des changements de séquence, pour deux raisons :

a) de très petits fragments de restriction sont difficiles à détecter en électrophorèse sur gel d'agarose
b) les régions de RTI non couvertes par les sites de restriction peuvent passer inaperçues après une mutation. De plus, la fraction de plasmides non intacts ne peut pas être quantifiée avec précision.
Le séquençage conventionnel de Sanger est utilisé pour vérifier l'intégrité globale de la séquence des plasmides finis avant libération. Les RTI sont toutefois notoirement difficiles à séquencer, ce qui peut donner des résultats indistincts.

Grâce à un type spécial de séquençage de nouvelle génération, établi par l'équipe de PlasmidFactory, les séquences RTI dans les plasmides de transfert VAA peuvent être séquencées et quantifiées, complétant ainsi les techniques de fermentation établies de PlasmidFactory pour maintenir les plasmides intacts.

Mini-cercles VAA (MC)
Les améliorations au niveau de l'ADN conduisent également à un rendement significativement plus élevé dans la fabrication de VAA : la mise au point des mini-cercles pour remplacer les plasmides pour la production de vecteurs VAA. Les séquences du squelette bactérien étant éliminées lors de la production de MC, l’encapsidation des séquences du squelette du plasmide procaryote est évitée. Cela revêt une importance particulière pour les préparations de vecteurs scVAA, qui contiennent une quantité non proportionnelle de séquences de squelette plasmidique. Le remplacement des plasmides par des constructions MC améliore en outre l'efficacité des préparations de VAA. Ainsi, la technologie MC offre une modification facile à mettre en œuvre des protocoles d'empaquetage VAA standard qui améliore considérablement les préparations de vecteurs VAA.

Contact :
PlasmidFactory GmbH & Co. KG

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